组蛋白去乙酰化酶8对肾性高血压大鼠心肌肥大的影响

曹珊珊， 李瑞芳， 方伟进， 王建刚， 李 艳， 张 博

(河南科技大学医学院药理教研室，河南洛阳471003)

高血压心肌肥厚是充血性心力衰竭重要的诱因及独立危险因子，高血压导致的心肌肥大在体循环高负荷长期存在时，心肌会发生失代偿，出现充血性心力衰竭，增加死亡率［1］。研究表明，基因转录调控功能的紊乱可以促进心肌细胞肥大和胚胎基因表达，从而影响心脏的功能［2］。基因调控与组蛋白的乙酰化和去乙酰化有关，而这一过程主要由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)调节。近年来国外有少数学者初步发现:在心肌肥厚过程中HDACs有可能发挥着一定的作用［3］。在心肌肥厚的十分复杂的信号网络中，HDACs是一个重要的下游融合节点，调节许多与肥厚相关的转录因子表达，可能是治疗心肌肥厚的一个很有意义和前景的作用靶标。资料显示，Ⅰ型HDACs中的HDAC1、2和3可促进心肌肥厚［4］，而HDAC8对心肌肥厚的影响未见报道，故本实验采用2肾2夹肾性高血压心肌肥厚模型，观察左心室肥厚时HDAC8的表达变化以及用丙戊酸钠(valproic acid sodium，VPA)抑制HDAC8的表达后对心肌肥厚的影响。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 丙戊酸钠(批号为090415)，购自南开允公药业;戊巴比妥钠购自上海化学试剂厂;ExTaq酶、RNase抑制剂、AMV购自TaKaRa;Trizol核酸提取试剂购自 Invitrogen;抗兔的多克隆抗体HDAC8(H-145)(稀释度1∶500)购自 Santa Cruz，抗鼠的单克隆抗体α-tubulin(稀释度1∶10 000)购自Sigma。

1.2 动物 体重90～110 g的雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心(合格证号为20100008)。

2 方法

2.1 心肌肥厚模型制备、分组及标本采集 参照文献［5］方法进行，以1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉，做背部后正中切口，分离肾动脉起始部0.5 cm处放置钛合金夹。假手术组仅分离肾动脉。术后2周血压开始上升，排除术后4周血压小于160 mmHg的大鼠。实验随机分为5组，每组10只。(1)假手术组(sham):腹腔注射等量生理盐水;(2)2肾2夹组(two-kidney two-clip，2K2C):腹腔注射等量生理盐水;(3)丙戊酸钠高剂量组(valproic acid sodiumhigh dose，VpaH):术后腹腔注射丙戊酸钠，400 mg·kg-1·d-1VPA;(4)丙戊酸钠低剂量组(VpaL):200 mg·kg-1·d-1VPA;(5)坎地沙坦组(candesartan，Can):按10 mg·kg-1·d-1灌胃;术后 4 周开始给药，连续给药4周，所有动物于术后8周摘取心脏，称取左心室(包括室间隔)重量(left ventricular weight，LVW)，并与体质量(body weight，BW)相除，计算左心室/体重比值(LVW/BW)。取左心室游离壁心肌放入10% 中性甲醛内，24 h后石蜡包埋切片，HE染色。其余心底以及心尖部分放入冻存管中液氮保存。

2.2 常规苏木素伊红(HE)染色 石蜡切片常规脱蜡至水，苏木素室温染10 min，快速自来水冲洗30～60 s;1%盐酸乙醇分化1 s，自来水冲洗1 min;伊红室温染5～10 min;梯度乙醇脱水;二甲苯透明;中性树胶封片，光镜观察拍照。

2.3 RT-PCR测定心肌组织心房利钠因子(atrial natriuretic factor，ANF)和 HDAC8 mRNA 表达 用Trizol提取心肌组织中的总RNA，测定总RNA纯度和水平，取2 μg总RNA样本在10μL反应体系中进行反转录反应，参照反转录试剂盒说明书进行，取cDNA 2 μL参照Taq酶说明书在10 μL体系中扩增。反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，65.1℃(ANF)或56.1℃(HDAC8)或52℃(18S)30 s，72℃ 50 s，30个循环(ANF)或35个循环(HDAC8)或27个循环(18S)，72℃ 10 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像并读出电泳带吸光度值，用目的条带与18S的吸光度比值来反映目的基因的相对表达量。引物由上海生工合成，ANF上游引物5'-CTG CTA GAC CAC CTG GAG GA-3'，下游引物 5'-AAG CTG TTG CAG CCT AGT CC-3'(Tm:65.1℃，320 bp)。HDAC8上游引物5'-CCA GAA GGT CAG CCA AGA-3'，下游引物 5'-TTC CGT CGC AAT CGT AAT-3'(Tm:56.1℃，267 bp)。18S上游引物5'-GTC CCC CAA CTT CTT AGA G-3'，下游引物5'-CAC CTA CGG AAA CCT TGT TAC-3'(Tm:52 ℃，419 bp)。

2.4 Western blotting测定HDAC8的表达 提取各组心肌组织总蛋白，考马斯亮蓝进行蛋白定量，并调整上样量为50 μg，10%SDS-PAGE，PVDF 膜印迹，室温封闭1 h，Ⅰ抗4℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，最后ECL发光法进行显色。LabWork 4.0凝胶蛋白分析软件对条带进行分析。

3 统计学处理

结 果

1 2肾2夹肾性高血压大鼠心肌组织中HDAC8的表达变化

图1A显示，各组大鼠心肌组织中均有HDAC8的表达，手术后8周，高血压大鼠左心室的HDAC8 mRNA含量明显上调，为假手术组的2.8倍(P＜0.05)，高、低剂量丙戊酸钠均可下调左心室HDAC8 mRNA的水平，分别降至2肾2夹组的50%和61%(P＜0.05)，且具有剂量依赖性。

图1B显示，2K2C大鼠左心室HDAC8蛋白的表达水平明显升高，为假手术组的1.7倍，给予高、低剂量的丙戊酸钠干预后，HDAC8的蛋白表达明显减少，分别降为2肾2夹组的约59%和65%。

Figure 1.The mRNA(A)and protein(B)expression of HDAC8 in the left ventricle of the two-kidney two-clip renovascular hypertensive rats after 8 weeks.The experiment was repeated three times with the same result.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.图1 2肾2夹高血压大鼠左心室HDAC8 mRNA和蛋白的表达变化

2 HDAC8抑制剂对大鼠左心室/体重比值的影响

2肾2 夹缩窄术后，大鼠的体重逐渐增长;给予丙戊酸钠后对体重增加没有明显影响，各组间没有显著差异。而表1显示，2肾2夹组大鼠的左心室/体重比值(LVW/BW)相对假手术组明显升高(P＜0.05)，提示2肾2夹组大鼠发生了明显的左心室肥厚。高剂量丙戊酸钠可以降低LVW/BW，能明显缓解这种肾性高血压引起的心肌肥厚。低剂量丙戊酸钠也有一定降低LVW/BW作用，但弱于高剂量组。阳性对照药坎地沙坦可以明显降低LVW/BW，效果与VPA高剂量组类似。

3 HDAC抑制剂对大鼠心肌组织形态学的影响

病理切片(HE)染色显示，与假手术组相比，2K2C组大鼠心肌细胞横径和表面积增大，边缘不规则，并有心肌细胞排列紊乱，细胞核增大、畸形等改变。坎地沙坦组明显抑制这种变化，丙戊酸钠高剂量组也能抑制这种变化，且效果优于低剂量组，见图2。

表1 各组大鼠2肾2夹术后8周LVW/BW的检测结果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

表1 各组大鼠2肾2夹术后8周LVW/BW的检测结果Table 1.Changes of ratio of left ventricular weight to body weight(±s.n=10)

*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs 2K2C.LVW:left ventricular weight;BW:body weight.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.

Group LVW(mg) BW(g)LVW/BW(mg/g)Sham 460±50 300±13 1.54±0.13 2K2C 600±60* 295±18 2.06±0.25*VpaH 470±40# 300±18 1.61±0.16##VpaL 530±15*# 303±7 1.89±0.29*#Can 460±7## 303±18 1.55±0.18##

Figure 2.Effects of VPA on the histomorphology of left ventricular myocardium 8 weeks after 2K2C operation(HE statining，×200).A:representative transversal section morphology;B:representative longitudinal section morphology.图2 2肾2夹术后8周丙戊酸钠对大鼠心肌组织形态学的影响

4 HDAC抑制剂对大鼠心肌组织中ANF mRNA表达的影响

在术后8周2肾2夹肾性高血压大鼠中，ANF mRNA的表达为假手术组的3.6倍(P＜0.05)，丙戊酸钠高、低剂量组均可抑制ANF mRNA的表达，分别降至2肾2夹组的36%和69%(P＜0.05)，见图3。

讨 论

Figure 3.Expression of ANF mRNA in the LV of rats treated with VPA or candesartan.The results were representative of three independent experiments.Sham:sham operation group;2K2C:two-kidney two-clip group;VpaH:high dose of valproate(400 mg·kg-1·d-1)group;VpaL:low dose of valproate(200 mg·kg-1·d-1)group;Can:candesartan(10 mg·kg-1·d-1)group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs sham;##P＜0.01 vs 2K2C.图3 各组大鼠心肌组织ANF mRNA的表达

高血压左室肥厚是以心肌细胞肥大及成纤维细胞增殖为主要病理学特征的高血压性脏器损害，因其病因不清、机制复杂，缺乏确切有效的防治措施［6］。近期研究发现HDACs抑制剂曲古抑菌素(trichostatin A，TSA)和VPA能够显著改善胸主动脉结扎(thoracic aortic banding，TAB)引起的心肌肥大和重构，还可以通过增加组蛋白的乙酰化来调节心脏肥大基因和胚胎期基因活化［7-8］。在体外培养的心肌细胞中，TSA可以上调α-肌球蛋白重链的表达，VPA可以下调HDAC2的表达来防止AngⅡ诱导的心肌肥大反应［9-10］。尽管上述体内和体外实验表明了HDACs抑制剂具有明显的抗肥厚作用，但上述体内模型与临床实际病变存在差距。主动脉结扎模型可以引起心脏后负荷的急剧增加，并不是一种反映高血压和动脉硬化引起的心脏病变的理想模型，所以我们选用更接近临床的2肾2夹肾性高血压模型观察HDACs抑制剂对心肌肥厚的作用。

目前，国外关于HDACs的研究主要集中在抗癌领域，而在心肌肥厚发病中的研究主要是通过基因敲除鼠来阐明不同HDACs亚型的功能［11］。我们前期研究发现在2肾2夹术后6周肾性高血压大鼠心脏中HDAC2的表达增加同时出现了显著的心肌肥大和纤维化，提示在肾性高血压大鼠的心肌重构中，HDACs起了十分重要的作用，但其同工酶HDAC8在2肾2夹肾性高血压大鼠左心室的表达是否增加，下调其表达对心肌肥厚的影响如何，尚未见报道。

本文在研究2肾2夹肾性高血压大鼠左心室肥厚的基础上首次观察到随着左室心肌细胞内HDAC8 mRNA和蛋白表达水平上调，心肌肥厚标志性基因ANF在左心室的表达也增加，提示HDAC8可能参与肾性高血压左心室肥厚发病过程并促进肥厚的发展。另外，本研究发现VPA可以剂量依赖性下调HDAC8 mRNA和蛋白表达，减少ANF mRNA表达，说明VPA在转录水平和蛋白水平对HDAC8都起着重要的调控作用。同时VPA治疗组左心室肥厚显著改善，心肌形态病理学改变得到部分逆转，左心室重量指数下降。上述结果提示HDACs抑制剂VPA可能通过下调HDAC8的表达逆转心肌肥厚。总之，我们的结果表明HDAC8参与了肾性高血压大鼠心肌肥厚的发病过程，下调其表达可以防止心肌肥厚的发生。为了进一步揭示HDAC8在心肌肥厚的作用机制，我们接下来将进一步检测与HDAC8相伴随的 calcineurin(CaN)和 Akt/GSK3β信号分子及转录因子NFATc4、AP-1的表达变化，从基因转录的乙酰化修饰调控对心肌肥大的发病机制进行探讨。

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