维生素K3增强三氧化二砷诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究
2012-09-13沈建平沈一平林圣云胡致平郑智茵周郁鸿
邓 姝 沈建平 沈一平 林圣云 胡致平 郑智茵 周郁鸿
(浙江省中医药大学附属第一医院血液科,浙江省杭州市邮电路54号,310006)
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种浆细胞恶性肿瘤。目前,对于晚期、复发和耐药MM患者的治疗仍然是一个难题。已有研究表明三氧化二砷(As2O3)在体外能够抑制骨髓瘤细胞的增殖并诱导凋亡[1]本实验通过研究 As2O3联合维生素 K3对 RPMI8226细胞增殖与凋亡的影响,期望为临床合理应用As2O3,治疗MM提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由本科室长期保存,实验从-80℃冰箱取出,快速复苏后传代培养备用。培养基为RPMI-1640培养液,于37℃,5%CO2培养箱培养,取对数生长期细胞用于实验。
1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640培养液:Sigma公司产品。小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所产品。四甲基噻唑氮蓝(MTT,华美生物工程公司),二甲亚砜(Sigma公司);Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美公司)。As2O3注射液(黑龙江伊达药业公司),维生素K3(无锡第七制药厂),两药使用前均用不含血清的RPMI-1640稀释至所需浓度。FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.3 研究方法
1.3.1 实验分组 根据所加药物不同分为4组,依次为空白对照组、维生素K3组、As2O3组、维生素K3+As2O3组。细胞培养取对数生长期细胞,以RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×105/mL。在24孔培养板中分别加入2mL细胞悬液。空白对照组加入培养液。维生素 K3组加入维生素 K3,浓度分别为2μmol/L,5μmol/L,10μmol/L。As2O3组加入 As2O3,使其终浓度为2μmol/L。维生素K3+As2O3组同时加入维生素K3和As2O3,各孔细胞悬液中As2O3的终浓度均为5μmol/L,维生素K3的终浓度分别为2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L(根据参考文献及多次预实验确定)。加药后 12h、24h、48h、72h 收集细胞。
1.3.2 MTT实验 用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将对数生长期的RPMI8226细胞配制成5×105个/mL细胞悬液,每孔200μL加入96孔培养板内。分别以不同的时间点和药物浓度作为一组,每组均设3个复孔及1个对照孔,对照孔加入空白对照孔的细胞。然后每孔加入5mg/mL MTT 20μL,再培养4h,离心,弃上清,每孔加200μL二甲亚砜,振摇至结晶溶解后用酶联仪测定吸光度A值(测试波长600nm)。以该组复孔的平均值作为该组细胞的A值。细胞生长抑制率=1-(A实验/A对照)×100%。
1.3.3 细胞周期检测 药物与RPMI8226细胞共同培养48h,每组收集1×106个细胞,70%(体积分数)乙醇4℃固定过夜,加入RNA酶,37℃水浴消化15~30min 以上,加入 PI,4℃存放 20min,加入适量 PBS,上流式细胞仪检测。重复实验3次。
1.3.4 流式细胞术AnnexinV/PI标记法检测凋亡As2O3及维生素K3单独及联合作用RPMI8226细胞同上,实验按照说明书操作,细胞周期检测药物与RPMI8226细胞共同培养48h,离心收集细胞106,PBS洗两次,用1×binding buffer 490μL重悬细胞,然后加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的Annexin V(FITC-Annexin V)和PI各5μL,置冰上作用10min,然后上流式细胞仪检测分析。重复实验3次。
1.4 统计分析 采用SPSS10.0统计软件做单因素方差分析和q检验。
2 结果
2.1 As2O3和As2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞的生长抑制作用 单用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L维生素K3对RPMI8226细胞生长有一定的抑制作用,且其作用呈时间和剂量依赖性;单用 2μmol/LAs2O3对 RPMI8226细胞生长有一定抑制作用,2μmol/LAs2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞生长抑制作用与维生素K3剂量和作用时间有关,2μmol/LAs2O3联合 2、5、10μmol/L 维生素 K3作用 48h、72h对RPMI8226细胞生长抑制显著(P<0.05)。
2.2 DNA含量分析 2μmol/LAs2O3作用于 RPMI8226细胞48h后,出现G0/G1期细胞增高,S期减少;2μmol/L As2O3联合5μmol/L维生素 K3作用于RPMI8226细胞48h后,出现G0/G1期细胞增高,S期降低,且2μmol/L As2O3联合5μmol/L维生素K3较单用2μmol/L As2O3后G0/G1期细胞增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
2.3 As2O3和As2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞的凋亡率影响 2μmol/LAs2O3和2μmol/LAs2O3联合5μmol/L维生素K3作用于RPMI8226细胞48h后,细胞凋亡率较空白对照组显著增高(P<0.05),且2μmol/L As2O3联合 5μmol/L维生素 K3较单用2μmol/L As2O3细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 示不同浓度的维生素K3和As2O3单独及联合作用48hRPMI8226细胞的凋亡率
不同剂量的As2O3、维生素K3单独及联合作用48h后细胞的凋亡率。分别为对照组,2μmol/L As2O3,2μmol/L As2O3+5μmol/L 维 生 素 K3组,2μmol/L As2O3+10μmol/L 维生素 K3组。
3 讨论
As2O3是中药砒霜的主要成分,随着医学的发展,砷的毒理、药理研究也有了进展,As2O3在体外可以诱导多种肿瘤细胞凋亡[2-3]。本实验表明:As2O3与维生素K3联合作用明显提高了RPMl 8226细胞对As2O3的敏感性、S期细胞减少、使MM细胞阻滞于G1期,并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。这与砷剂能使淋系肿瘤发生G1期阻滞和使NB4细胞发生G2/M期阻滞结果一致[4]。近年来国外不少学者报道,维生素K3对某些肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞发生凋亡[5]。近年来国外不少学者报道,维生素K3对某些肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞发生凋亡[6]。用As2O3与维生素K3联合治疗MM,可以减少As2O3的用量,降低砷剂对机体的毒性,起到增效减毒的作用,为临床治疗复发、难治MM提供了新思路。
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