维生素K3增强三氧化二砷诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

邓 姝 沈建平 沈一平 林圣云 胡致平 郑智茵 周郁鸿

(浙江省中医药大学附属第一医院血液科，浙江省杭州市邮电路54号，310006)

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种浆细胞恶性肿瘤。目前，对于晚期、复发和耐药MM患者的治疗仍然是一个难题。已有研究表明三氧化二砷(As2O3)在体外能够抑制骨髓瘤细胞的增殖并诱导凋亡［1］本实验通过研究 As2O3联合维生素 K3对 RPMI8226细胞增殖与凋亡的影响，期望为临床合理应用As2O3，治疗MM提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由本科室长期保存，实验从－80℃冰箱取出，快速复苏后传代培养备用。培养基为RPMI－1640培养液，于37℃，5%CO2培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2 主要试剂及仪器 RPMI1640培养液:Sigma公司产品。小牛血清:杭州四季青生物工程材料研究所产品。四甲基噻唑氮蓝(MTT，华美生物工程公司)，二甲亚砜(Sigma公司);Annexin－V－FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美公司)。As2O3注射液(黑龙江伊达药业公司)，维生素K3(无锡第七制药厂)，两药使用前均用不含血清的RPMI－1640稀释至所需浓度。FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 实验分组 根据所加药物不同分为4组，依次为空白对照组、维生素K3组、As2O3组、维生素K3+As2O3组。细胞培养取对数生长期细胞，以RPMI－1640培养液调整细胞浓度至2×105/mL。在24孔培养板中分别加入2mL细胞悬液。空白对照组加入培养液。维生素 K3组加入维生素 K3，浓度分别为2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L。As2O3组加入 As2O3，使其终浓度为2μmol/L。维生素K3+As2O3组同时加入维生素K3和As2O3，各孔细胞悬液中As2O3的终浓度均为5μmol/L，维生素K3的终浓度分别为2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L(根据参考文献及多次预实验确定)。加药后 12h、24h、48h、72h 收集细胞。

1.3.2 MTT实验 用含10%小牛血清的RPMI－1640培养液将对数生长期的RPMI8226细胞配制成5×105个/mL细胞悬液，每孔200μL加入96孔培养板内。分别以不同的时间点和药物浓度作为一组，每组均设3个复孔及1个对照孔，对照孔加入空白对照孔的细胞。然后每孔加入5mg/mL MTT 20μL，再培养4h，离心，弃上清，每孔加200μL二甲亚砜，振摇至结晶溶解后用酶联仪测定吸光度A值(测试波长600nm)。以该组复孔的平均值作为该组细胞的A值。细胞生长抑制率=1－(A实验/A对照)×100%。

1.3.3 细胞周期检测 药物与RPMI8226细胞共同培养48h，每组收集1×106个细胞，70%(体积分数)乙醇4℃固定过夜，加入RNA酶，37℃水浴消化15～30min 以上，加入 PI，4℃存放 20min，加入适量 PBS，上流式细胞仪检测。重复实验3次。

1.3.4 流式细胞术AnnexinV/PI标记法检测凋亡As2O3及维生素K3单独及联合作用RPMI8226细胞同上，实验按照说明书操作，细胞周期检测药物与RPMI8226细胞共同培养48h，离心收集细胞106，PBS洗两次，用1×binding buffer 490μL重悬细胞，然后加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的Annexin V(FITC－Annexin V)和PI各5μL，置冰上作用10min，然后上流式细胞仪检测分析。重复实验3次。

1.4 统计分析 采用SPSS10.0统计软件做单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 As2O3和As2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞的生长抑制作用 单用2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L维生素K3对RPMI8226细胞生长有一定的抑制作用，且其作用呈时间和剂量依赖性;单用 2μmol/LAs2O3对 RPMI8226细胞生长有一定抑制作用，2μmol/LAs2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞生长抑制作用与维生素K3剂量和作用时间有关，2μmol/LAs2O3联合 2、5、10μmol/L 维生素 K3作用 48h、72h对RPMI8226细胞生长抑制显著(P＜0.05)。

2.2 DNA含量分析 2μmol/LAs2O3作用于 RPMI8226细胞48h后，出现G0/G1期细胞增高，S期减少;2μmol/L As2O3联合5μmol/L维生素 K3作用于RPMI8226细胞48h后，出现G0/G1期细胞增高，S期降低，且2μmol/L As2O3联合5μmol/L维生素K3较单用2μmol/L As2O3后G0/G1期细胞增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.3 As2O3和As2O3联合维生素K3对RPMI8226细胞的凋亡率影响 2μmol/LAs2O3和2μmol/LAs2O3联合5μmol/L维生素K3作用于RPMI8226细胞48h后，细胞凋亡率较空白对照组显著增高(P＜0.05)，且2μmol/L As2O3联合 5μmol/L维生素 K3较单用2μmol/L As2O3细胞凋亡率增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 示不同浓度的维生素K3和As2O3单独及联合作用48hRPMI8226细胞的凋亡率

不同剂量的As2O3、维生素K3单独及联合作用48h后细胞的凋亡率。分别为对照组，2μmol/L As2O3，2μmol/L As2O3+5μmol/L 维 生 素 K3组，2μmol/L As2O3+10μmol/L 维生素 K3组。

3 讨论

As2O3是中药砒霜的主要成分，随着医学的发展，砷的毒理、药理研究也有了进展，As2O3在体外可以诱导多种肿瘤细胞凋亡［2－3］。本实验表明:As2O3与维生素K3联合作用明显提高了RPMl 8226细胞对As2O3的敏感性、S期细胞减少、使MM细胞阻滞于G1期，并抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。这与砷剂能使淋系肿瘤发生G1期阻滞和使NB4细胞发生G2/M期阻滞结果一致［4］。近年来国外不少学者报道，维生素K3对某些肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞发生凋亡［5］。近年来国外不少学者报道，维生素K3对某些肿瘤细胞系的增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞发生凋亡［6］。用As2O3与维生素K3联合治疗MM，可以减少As2O3的用量，降低砷剂对机体的毒性，起到增效减毒的作用，为临床治疗复发、难治MM提供了新思路。

［1］Grad J M，Balis N J，Krett N，et al.Arsenic trioxide uses caspasedependent and caspase － independent pathways in myeloma cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(11):1155 －1164.

［2］YI Jing，YANG Jie，HE Rong，et al.Emodin enhances arsenicinducedapoptosis via generation of reactive oxygen species andinhibition of survival signaling［J］.Cancer Res，2004，64:108 －116.

［3］周宇红，黄晓瑞，蔡循，等.三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞凋亡机制研究［J］.中华肿瘤杂志，2001，23(3):181 －183.

［4］Rousselot P，Labaume S，Marolleau J P，et al.Arsenic t rioxide and melarsoprol induce apoptosis in plasma cell lines and in plasma cells f rom myeloma patient s.Cancer Res，1999，59:1041 －1048.

［5］徐波，王洁，卞度宏.三氧化二砷体外诱导宫颈癌细胞株凋亡及其机制的研究［J］.实用医学杂志，2006，22(3):245 －247.

［6］Rajkumar S V，Leong T，Roche PC，etal.Prognostic value of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma［J］.Clin Cancer Res，2000，6(8):3111－3116.