植物反应器在动物疫苗研究中的应用

王淼 王建民 葛云侠 杨艺 史振声

摘要：用植物生产像疫苗这样高价值的药用产品，这一概念已经提出了２０年。直到现在为止这项技术仍不是十分成熟。最初人们都看好瞬时表达；证实了这种疫苗对人和动物是有效的；有些植物疫苗已经进入了人的Ⅰ期临床试验，还有一些正准备进行；监管的要求比以往更加严格。生产注射用产品可能会比生产可食用疫苗容易。该技术已被证明更廉价，更易于寻找生产材料。由于植物疫苗对于生产抵御引起大流行的病毒快速应答疫苗有无法替代的优势，在未来将会为人类的发展做出巨大的贡献。

关键词：动物疫苗；植物反应器；转基因植物；转基因表达

中图分类号：S852.4；Q943.2文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）16－3425-02

Ｐｌａｎｔ－Mａｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌｓ

ＷＡＮＧ Ｍｉａｏａ，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ－ｍｉｎａ，ＧＥ Ｙｕｎ－ｘｉａｂ，ＹＡＮＧ Ｙiａ，ＳＨＩ Ｚｈｅｎ－ｓｈｅｎｇｃ

（ａ．Cｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Aｎｉｍａｌ Sｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Vｅｔｅｒｉｎａｒｙ Mｅｄｉｃｉｎｅ； ｂ．Sｃｈｏｏｌ ｏｆ Bｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；

ｃ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０８６６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈｉｇｈ－ｖａｌｕｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｓ ２０ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ ａｎｄ ｉｓ ｏｎｌｙ ｎｏｗ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｉｎｋ ｏｆ ｒｅａｌｉｓａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｒｅｌｉａｎｃｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｈａｓ ｌａｒｇｅｌｙ ｇｉｖｅｎ ｗａｙ ｔｏ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｒｏｏｆｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｏｆ ｅｆfiｃａｃｙ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ； ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｎｔ－ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｈａｓｅ Ⅰ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｍｏｒｅ ａｒｅ ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ； ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｍｏｒｅ ｃｌｅａｒ ｔｈａｎ ｅｖｅｒ． Ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｐｔ ｏｆ ｃｈｅａｐ ｅｄｉｂｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｈａｓ ｇｉｖｅｎ ｗａｙ ｔｏ ａ ｒｅａｌｉｓａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｗｅｌｌ ｂｅ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ． Ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｐｒｏｖｅｎ ｉｔｓ ｗｏｒｔｈ ａｓ ａ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｃｈｅａｐ， ｅａｓｉｌｙ ｓｃａｌａｂｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｉｔ ｎｏｗ ｎｅｅｄｓ ｔｏ fiｎｄ ｉｔｓ ｎｉｃｈｅ ｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅａｌｉｓｅｄ ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ fiｅｌｄ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ was ｒｅｖｉｅｗｅｄ， ｓｕｃｈ ａｓ ｒａｐｉｄ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒｕｓｅｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｄｅｍｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｒｒｏｒ ａｇｅｎｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｖａｃｃｉｎｅ； ｐｌａｎｔ； ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ； ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

用植物反应器大批量生产廉价疫苗在这２０年里一直是科研工作者的努力方向，现在用来做植物疫苗的植物和系统有很多［１］，包括烟草、拟南芥、苜蓿、菠菜、马铃薯、微藻、草莓、胡萝卜、番茄、芦荟和单细胞藻类等。外源蛋白已经成功地在玉米、水稻、大豆和烟草的种子，马铃薯、番茄和草莓的果实，烟草和玉米的悬浮细胞，发根培养物还有多种植物的叶绿体中表达。本文将从表达宿主的角度对植物疫苗近些年来的研究成果进行总结，并对未来进行展望。

１果实和根茎

在对可使用果实和根茎类植物的研究中，番茄是较为合适的选择。Ｐａｚ等［２］在转基因番茄中表达了人乳头瘤病毒嵌合蛋白１６Ｌ１（ＨＰＶ－１６Ｌ１），将ＨＰＶ－１６ Ｅ６和Ｅ７两个蛋白进行串联表达，试验表明，这种有预防和治疗作用的重组疫苗可以从植物获得，尽管植物表达的病毒样颗粒可以同时刺激机体产生抗体和Ｔ细胞应答，遗憾的是表达量特别低，只占可溶性总蛋白的０．０５％～０．１０％。Ｔｈａｎａｖａｌａ等［３］利用马铃薯表达ＨｂｓＡｇ，临床试验中对志愿者进行常规免疫，可以产生免疫反应，但表达量不高。Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ等［４，５］在鲤鱼饲料里加入转基因马铃薯提取物，结果在肠道里检测出了含有绿色荧光蛋白的ＬＴ－Ｂ，同时引起了特异性的全身免疫反应。

２可食用多叶作物

现在，苜蓿、菠菜、羽扇豆、莴苣这一类的可食用多叶作物已经成功地用来生产抗原。最值得瞩目的是Ｗｅｂｓｔｅｒ等［６］的研究，他们成功地在转基因生菜中表达了麻疹病毒血凝素（ＭＶ－Ｈ）蛋白，并激发了小鼠的免疫反应。这是首次证明植物来源的ＭＶ－Ｈ可以诱导小鼠产生中和抗体；其次，这种ＤＮＡ介导的麻疹免疫可能会极大地推动口服植物来源麻疹病毒疫苗的发展。

３种子

现在应用可食用或经简单处理就可食用的种子研究出了大量的细菌和病毒的抗原或抗体。ＰｒｏｄｉＧｅｎｅ公司围绕着用玉米种子生产多种疫苗和其他蛋白开展了很多研究，并且得到了一种可以作为传染性胃肠炎病毒亚单位疫苗的玉米，这种玉米可以有效地激发猪的全身免疫和粘膜免疫［７］。Ｗｕ等［８］研究了能够表达传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２蛋白的水稻，将种子给鸡食用，可以获得较好的免疫保护。最近一项研究，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等［９］在水稻中构建了一个猪蛔虫（ｓ-１６）保护性抗原与霍乱毒素（ＣＴ）Ｂ亚单位（ＣＴＢ）的融合体，给小鼠口服可以产生ｓ－１６特异性抗体反应，攻毒后肺部虫体的检出量少于对照组。

４非食用作物

用烟草作为植物反应器已有报道，在这里不作过多的说明。早期正是烟草的使用证明了植物疫苗的可行性。２０年前人们第一次用植物反应器得到了疫苗相关蛋白。近几年Ｂｉｅｍｅｌｔ等［１０］、Varsani等［11］的研究，在转基因烟草和马铃薯中分别得到了两种不同的人乳头瘤病毒。虽然表达量很低（最大３０ ｍｇ／ｋｇ），但证明植物反应器不仅可以表达蛋白样疫苗，病毒样疫苗也同样可以表达。

５叶绿体／质的表达

尽管早期的研究工作多是在经典植物转基因表达或核转化方面，近些年关于利用叶绿体作为反应器也越来越受到关注。有人担心糖基化的过程会遇到障碍，新的研究发现，这个过程可以在成熟叶绿体中的内质网和高尔基体中完成［１２］。不出所料，细菌源性的抗体表达可以在叶绿体中表达，他们具有相似的蛋白质折叠机制，并且没有下游像糖基化这样的加工过程。Ｃｈｅｂｏｌｕ等［１３］在叶绿体中高效表达了对阿米巴原虫ＬａｃＡ凝集素片段非常有效的免疫原性抗原（每年有１００多万人死于阿米巴原虫感染），皮下注射小鼠试验产生了高水平的ＩｇＧ滴度。设想一下如果每株植株产生２４ ｍｇ ＬａｃＡ，那么每０．４０５ ｈｍ２转基因植物可以生产２９００万剂的疫苗。Ｓｃｏｔｔｉ等［１４］将ＨＩＶ 蛋白成功地在转基因烟草中表达，表达量约为３６０ ｍｇ／ｋｇ，同时将其组装进入能在动物细胞复制的类病毒。这样一来，就可以在植物中大量生产与ＨＩＶ相关的疫苗。

６细胞培养系统

有两个例子说明细胞培养系统是可行：一是目前世界上用于人体试验的治疗性蛋白是用胡萝卜悬浮细胞或者烟草细胞生产的重组人葡萄糖脑苷酶。二是惟一一个授权生产的产品，新城疫纯化注射疫苗，它是由美国Ｄｏｗ Ａｇｒｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ公司研究的烟草悬浮细胞系生产的。２００９年６月１６日Ｇｅｎｚｙｍｅ网站称，他们用ＣＨＯ细胞生产出用来治疗因为感染杯状病毒（囊病毒２１１７）引起的戈谢病的干扰素。最新的报告指出：美国食品和药品管理局已和那些在做戈谢病酶替代疗法临床试验的公司签署协议，允许他们的药品在获得正式批准前使用。

７展望

虽然植物疫苗历经了２０年的研究，还没有一种通过Ⅰ期临床试验。但是用植物反应器生产动物疫苗和生物制剂具有不需要昂贵的发酵和纯化系统、冷链运输和严格的无菌操作的优势。研究人员通过对稳态表达系统的研究，利用组织特异性表达和诱导表达的方法成功地获得了大量的转基因谷物。不过评价一个表达系统优劣的关键还是在于表达量的高低，而转基因疫苗的表达量限制了其成为商业疫苗。叶绿体系统虽然能够高效地表达各种蛋白，但因为没有下游糖基化过程使得糖类无法表达。总的来说，尽管植物表达系统为生产疫苗抗原和生物制剂提供了新途径，但是在表达量、纯化方法、功能特异性、口服给药以及临床试验方面还需要更深入的研究。

参考文献：

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［７］ ＬＡＭＰＨＥＡＲ Ｂ Ｊ， ＪＩＬＫＡ Ｊ Ｍ， ＫＥＳＬ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｒｎ－ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ａｎ ｏｒａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｂｏｏｓｔｓ ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｓｗｉｎｅ［Ｊ］． Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２（１９）：２４２０－２４２４．

［８］ ＷＵ Ｊ， ＹＵ Ｌ， ＬＩ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＶＰ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，２００７，５（５）：５７０－５７８．

［９］ ＭＡＴＳＵＭＯＴＯ Ｙ，ＳＵＺＵＫＩ Ｓ，ＮＯＺＯＹＥ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆfiｃａｃｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ （Ａｓ１６） ｏｆ Ａｓｃａｒｉｓ ｓｕｕｍ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ Ｂ ｓｕｂｕｎｉｔ［Ｊ］． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ，２００９，１８（２）：１８５－１９２．

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