复合生物保鲜剂在冷却肉保鲜中的应用

韩晋辉，翟培，*，孙勇民

（1.广东食品药品职业学院，广东广州510520；2.天津现代职业技术学院，天津300350）

复合生物保鲜剂在冷却肉保鲜中的应用

韩晋辉1，翟培1，*，孙勇民2

（1.广东食品药品职业学院，广东广州510520；2.天津现代职业技术学院，天津300350）

具有抗菌作用的合成多肽与茶多酚制成复合生物保鲜剂，通过涂抹于冷鲜肉表面研究其保鲜作用。测定复合保鲜剂处理后冷却肉的挥发性盐基氮以及感官指标后发现，复合生物保鲜剂可以有效延长冷却肉在0℃～4℃条件下的贮藏时间，保鲜时间达到15 d以上。

合成肽；复合保鲜剂；冷却肉

Abstract:Synthetic peptide with antimicrobial activity and tea polyphenol made from bio-preservative for the preservation of chilled pork.Detected TVB-N value,sensory quality of chilled pork.The results showed that compound bio-preservative can increase the freshness and shelf life of chilled pork,shelf life could extend to 15 d at 0℃-4℃.

Key words：synthetic peptide;preservative compound;chilled pork

冷却肉在生产、销售中要求始终处于0℃～4℃条件下，此时大多数微生物的生长繁殖被抑制，可以确保肉的安全卫生，但并不能完全抑制所有微生物的生长繁殖，一些嗜冷菌，如单核细胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）和假单胞菌属（Pseudomonas）等，在冷藏条件下仍然会大量生长和繁殖，最终导致冷却肉发生腐败变质[1]。冷却肉的表面褐变是冷却肉在销售过程中常出现的另一类问题，在冷却肉的货架期内应使腐败变质和表面褐变控制到最低程度，目前这两方面的问题已经成为限制冷却肉大力推广和普及的主要障碍[2]。冷却肉的腐败主要是由于微生物繁殖到一定程度后会分泌蛋白酶，使蛋白质分解为多肽和氨基酸，有的氨基酸进一步被分解为硫化氢、吲哚、甲基吲哚和甲胺等有恶臭的物质，并且有毒性；褐变主要原因是脂肪被氧化，产生过氧化物，促进肌红蛋白变色，最终使生肉表面失去光泽，发黏，并产生腐败臭气，甚至长霉。

目前，食品产业应用最广泛的保鲜剂是化学保鲜剂。用化学保鲜剂处理能快速抑制冷却肉表面的腐败菌，显著延长产品保质期。但有些化学保鲜剂会影响冷却肉的外观，如肉色色泽变淡、汁液流失等问题。一些化学合成防腐剂过量使用对人体是有害的,许多国家的食品卫生标准都规定了最大允许使用量。随着人们对食品安全的重视，越来越多的研究着力于相对化学保鲜剂更加安全环保的生物保鲜剂，生物保鲜剂极有可能代替化学保鲜剂。本实验所用合成多肽是根据天蚕素类抗菌肽的保守序列，通过生物信息学设计出的全新多肽。利用合成多肽与抗氧化物质茶多酚组成复合保鲜剂，对冷却肉的保鲜效果进行研究，期望取得冷却肉保鲜方法的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为广东食品药品职业学院实验实训中心保存。

1.1.2 主要试剂

多肽AMP-D：上海肽仕生物科技有限公司合成；营养肉汤、PBS缓冲液、无水乙醇、茶多酚（符合食品添加剂标准）等。

1.1.3 主要仪器

DNM9602酶标仪：北京普朗新技术有限公司；FA2004分析天平：上海舜宇恒平科学仪器公司；SB-5200DTN超声波清洗仪：上海益联科教设备有限公司；GI6-2烘箱：常熟市双杰测试仪器厂；LX-B75L灭菌锅：广州市予华仪器有限公司；LRH-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：上海比朗仪器有限公司；96孔板等。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性测定和最低抑菌浓度（MIC）的测定

将0.1mg/mL的合成多肽溶液倍比稀释，当金黄色葡萄球菌培养至对数期(浓度为106cfu/mL~107cfu/mL）后，向96孔板中加入 150 μL菌悬液、30 μL不同浓度的合成多肽，然后放入37℃，100 r/min摇床中培养，待培养24 h后，每孔分别加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃100 r/min避光培养4 h后，观察其颜色变化，以无水乙醇为对照组[3]。

1.2.2 热处理对抑菌活性的影响

将合成多肽溶液置于不同温度的水浴中（40、50、60、70、80℃）加热15min。分别向96孔板中加入150μL菌悬液（菌浓度为106cfu/mL~107cfu/mL）以及加热后合成多肽 30 μL（浓度为 0.1 mg/mL），放入 37℃，100 r/min摇床中培养，待培养24 h后，每孔分别加入20 μL 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC），37℃ 100 r/min避光培养4 h，酶标仪测定578 nm处吸光值。

1.2.3 挥发性盐基氮的测定

将浓度为0.05 mg/mL的合成多肽溶液与0.1%茶多酚溶液按照1∶1比例混合，制成复合保鲜剂，将溶液涂抹于冷鲜肉表面，用保鲜膜包裹置于0℃～4℃下冷藏17 d，根据挥发性盐基氮的测定原理，按照GB5009.44－2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中微量扩散法对样品和空白每日分别进行测定。

1.2.4 复合保鲜剂处理后的感官检测

复合保鲜剂涂抹于冷鲜肉表面，用保鲜膜包裹标记，置于4℃冷藏，并每间隔一天进行一次感官评定。感官评定标准根据GB 2707-94《猪肉卫生标准》执行，由5名评价员进行打分，结果取平均值，评定指标见表1。

表1 感官指标评价表Table 1 Sensory evaluation standards for chilled pork

2 结果与分析

2.1 抑菌活性测定和最低抑菌浓度（MIC）的测定结果

合成多肽是以天蚕素类抗菌肽为基础，人工设计出的一种抗菌肽，经实验发现，合成多肽对革兰氏阳性菌有明显的杀灭作用，多肽序列如下：KIGKKLEGVG KRVAVISDSHAKRLVGQAAALAK[4]。TTC是一种活菌染料，其氧化态是无色的，该染料进入细胞后，TTC和活细胞内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的还原产物甲臜。抑菌活性测定和最低抑菌浓度（MIC）的测定结果见表2。

表2 合成肽对金黄色葡萄球菌MIC测定结果Table 2 The result of MIC polypeptide against Listeria monocytogenes

从表2可以看出，经TTC染色后，培养基的颜色随合成多肽浓度的增加而变浅，直至无色。表明合成多肽可抑制金黄色葡萄球菌的生长，且抑制作用随多肽浓度的增加而增强。当合成多肽的浓度大于0.07 mg/mL（终浓度为：10.5 μg/mL）时，即可完全抑制金黄色葡萄球菌的生长，故其对金黄色葡萄球菌的MIC为 10.5 μg/mL。

2.2 热处理对抑菌活性的影响

不同温度处理后的多肽加入到菌液中，37℃培养24 h后，加入TTC溶液，在578 nm处测吸光值[5]。多肽热处理后对抑菌活性的影响见图1。

由图1可以看出，在加热温度小于60℃时，温度对多肽抑菌活性影响不大，随着温度增加，多肽活性逐渐减弱。由此实验可以看出合成多肽具有一定的耐热性，具有良好的加工特性。这可能与多肽的二级结构有关系，合成多肽的二级结构以α-螺旋结构为主，结构较为稳定，因此对加热不是十分敏感。

2.3 挥发性盐基氮的测定

按照GB 5009.44－2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》挥发性盐基氮评价标准：一级鲜肉15 mg/100 g以下；二级鲜肉20 mg/100 g以下；变质肉20 mg/100 g以上。本实验采用GB 5009.44－2003中挥发性盐基氮的测定方法，测定结果见图2。

由图2可以看出，空白组在0℃～4℃储藏过程中TVB-N值上升较快，11 d时TVB-N值已经超过20 mg/100 g，即冷却肉已经腐败；经过多肽溶液涂膜以后的冷却肉贮藏时间明显比空白组延长，第17天测定TVB-N值时仍然小于20 mg/100 g。由此可见，多肽溶液可以明显阻止微生物的繁殖，从而有效延长了冷却肉的货架期。

2.4 复合保鲜剂对冷鲜肉感官指标的影响

茶多酚溶液颜色较深，为了不影响冷却肉的外观，使用时溶液浓度较低，终浓度仅为0.05%，但在抗氧化方面起到了较好的效果。根据GB 2707-94《猪肉卫生标准》执行标准，5名评价员打分结果见表3。

表3 0℃～4℃条件下肉样感官指标综合评分结果Table 3 Result of sensory quality score of chilled pork at 0℃-4℃

由表3可以看出，未经复合保鲜剂处理的冷却肉在第9天时综合评分为3分，感官指标显著低于处理后冷却肉的感官评价值。经复合保鲜剂处理的冷却肉在第15天时感官评价值仍然达到鲜肉的评分范围，可见复合保鲜剂可以有效延长冷却肉的保藏期限。

3 结论

合成多肽对革兰氏阳性菌有较好的抑制和杀灭作用，包括对嗜冷菌单核细胞李斯特增生菌（Listeria monocytogenes）等多种微生物，因此合成多肽与茶多酚组成的复合保鲜剂可以起到显著的保鲜作用，在0℃～4℃条件下，冷却肉的保鲜时限可以达到15 d以上。由于合成多肽对革兰氏阴性菌和真菌没有抑制作用，对冷却肉保鲜时限的进一步延长有望通过合成多肽与其它抑制阴性菌的保鲜物质共同作用实现。

[1]卢士玲,李开雄,徐幸莲.不同生物保鲜剂对冷鲜肉抑菌效果的研究进展[J].肉类研究,2008(2):38-41

[2]何晓燕,蒋其斌,夏天兰,等.不同浓度茶多酚对冷却肉的影响分析[J].食品工业科技,2010,31(6):81-83

[3]王倩,谢明杰.木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其机制[J].微生物学报,2010,50(9):1180-1184

[4]韩晋辉,翟培.天蚕素类抗菌肽的结构设计及活性预测[J].农产品加工(学刊),2011(2):32-35

[5]吴窈画,谈书华,范超超,等.MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析[J].微生物学杂志,2011,21(3):67-71

Application of Composite Biological Preservation of Chilled Pork

HAN Jin-hui1,ZHAI Pei1,*，SUN Yong-min2
（1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520,Guangdong,China;2.Tianjin Modern Vocational Technology College,Tianjin 300350,China）

2011-11-27

广东食品药品职业学院院级资助课题（2009YZ003）

韩晋辉（1979—），男（汉），实验师，硕士，研究方向：营养与生物技术。

*通信作者：翟培（1980—），女，讲师。