葡萄糖对螺旋藻生长的影响及机理分析

田华，于斐，汪金萍

（1.信阳师范学院 生命科学学院，河南信阳464000；2.郑州大学公共卫生学院，河南郑州450052；3.信阳农业高等专科学校生物技术系，河南信阳464000）

葡萄糖对螺旋藻生长的影响及机理分析

田华1，于斐2，汪金萍3

（1.信阳师范学院 生命科学学院，河南信阳464000；2.郑州大学公共卫生学院，河南郑州450052；3.信阳农业高等专科学校生物技术系，河南信阳464000）

研究葡萄糖对螺旋藻生长的影响，结果表明，葡萄糖浓度为3.0 g/L时,干重最大，是对照的1.29倍，并发现采用不灭菌Zarrouk培养基混合营养培养螺旋藻是可行的。葡萄糖对螺旋藻生长的影响机理可能是外源葡萄糖对螺旋藻细胞的生理和代谢产生影响，使整个细胞处于比较活跃的生理状态，导致螺旋藻光合反应速率增加、光饱和值升高、暗呼吸和光补偿点也显著提高，藻生物量浓度较光合自养有很大程度提高。

钝顶螺旋藻；混合营养培养；葡萄糖；pH

Abstract:Influence of glucose on the cell dry weight of Spirulina platensis was studied.The results showed that when glucose concentration was 3.0 g/L,the cell dry weight was up to the highest,which was 1.29 times to the same culture without glucose.At the same time,we found that mixotrophic culture of Spirulina platensis used the medium of Zarrouk without sterilizling was feasible.The mechanisms maybe was that glucose influences the physiological and metabolism of Spirulina platensis cells and makes the whole cells in comparative active physiological condition,so result in photosynthetic reaction rate increasing,spirulina saturated value,dark light breathing and compensation points increasing significantly,the biomass of Spirulina platensis improving greatly compared with phototrophic culture.

Key words：Spirulina platensis;mixotrophism;glucose;pH

螺旋藻是一种单细胞丝状蓝藻，蛋白质含量高达60%~70%，并含有人体自身不能合成的8种氨基酸，且氨基酸含量平衡，富含维生素、多不饱和脂肪酸、碳水化合物及微量元素等[1]。目前已应用于食品、保健品、医药、饲料等领域，因此螺旋藻是一项具有巨大开发潜力和利用价值的多功能产品。近年来发现螺旋藻可以利用葡萄糖等有机底物进行混合营养培养，葡萄糖对螺旋藻生长影响的研究已有不少报道[1-6]，研究表明葡萄糖对螺旋藻生物量的积累具有促进作用，但影响的机理还不明确。并且添加葡萄糖混合营养大规模培养需提前对培养基进行高压灭菌，操作复杂，生产成本提高。因此本文从简化操作、节约生产成本的目的出发，对培养螺旋藻的Zarrouk培养基进行不灭菌混合营养培养实验，通过对培养液进行污染检查，探讨高密度混合营养培养的可行性，并分析葡萄糖促长的可能机理，期望为大规模工业化混合营养培养螺旋藻提供可靠的参数。

1 材料与方法

1.1 藻种和培养方法

供试藻种为钝顶螺旋藻fachb-350 Spirulinaplatensis：引自中国科学院武汉水生生物研究所；采用Zarrouk培养基作为基本培养基,未经高温灭菌。在混合营养培养过程中，添加一定量的葡萄糖，使其形成一浓度梯度：0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L。培养基的初始 pH为9.5，30℃恒温光照摇床培养9 d，4 klx光照，摇瓶速度为120 r/min。每天定时测定培养液中pH。同时设立对照。

1.2 仪器设备

ZHWY-111B大容量恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；AR520型电子精密天平：奥豪斯仪器公司；0.45 μm微孔滤膜：上海市新亚净化器件厂；pHS-3C数字式酸度计：上海虹益仪器仪表有限公司；LX-101数字光度表：美国Lutron公司；ECLIPSE-E200显微镜：Nikon公司；DB-206SC电热鼓风干燥箱：成都天宇实验设备有限责任公司。

1.3 细胞浓度的测定

细胞干重的测定见文献[7]。

1.4 培养液污染检查[8]

在显微镜下观察细胞的形态和可能的染菌情况，并采用平板涂布的方法进行进一步的检查。具体操作如下：取1 mL的藻液均匀涂布在LB固体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，pH7.0）上，置于30℃恒温培养箱中，检查是否形成菌落及形成个数。若每毫升藻液活菌数量达到1×10-3个菌落，此时杂菌浓度相当于1 μg/L，则认为藻液已被污染，重新进行培养。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖浓度对螺旋藻混合营养分批培养的影响

图1描述了不同葡萄糖浓度对螺旋藻混合营养培养分批培养干重的影响。

由图1可以看出，与对照组相比，添加葡萄糖的藻体生长较快，培养9 d的生物量较光合自养均有不同程度的提高。其中葡萄糖浓度为3.0 g/L时，干重是对照的1.29倍，说明在螺旋藻培养过程中添加葡萄糖可以大大提高螺旋藻的生物量。在实验过程中发现当葡萄糖浓度达到4.0 g/L时，螺旋藻颜色变黄，生长受到抑制，用针头滤器过滤时藻液中有黄色大分子难溶物，可能为藻体异常代谢物。其余的葡萄糖浓度分别为 0.0、1.0、2.0、3.0 g/L 的培养稳定，颜色墨绿，在显微镜下观察发现藻体排列规律，呈正常的螺旋状，没有异形物。由此可见3.0 g/L的葡萄糖浓度是支持该藻株混合营养分批培养的最佳浓度。

2.2 混合营养分批培养过程中pH的变化

螺旋藻培养过程中，培养液的pH是螺旋藻在一定环境下代谢产物的综合指标，是一项重要的培养参数，螺旋藻对pH适应范围，取决于螺旋藻的生态学，在培养过程中pH会随着基础培养基的组成、培养条件及藻类繁殖代谢而不断波动，如果培养液的pH偏高或偏低，螺旋藻的生长繁殖和产物积累就要受到显著影响。因此，在研究葡萄糖对螺旋藻生长的影响研究中有必要对螺旋藻混合营养培养过程中的pH变化进行详细的研究，以分析葡萄糖对螺旋藻生长的促长机理。螺旋藻混合营养分批培养过程中的pH变化，见图2。

图2中斜率代表pH的变化率，从图2中可以看出，不添加葡萄糖的培养液随培养时间的延长变化较快，原因主要是不添加葡萄糖的培养液中，NaHCO3作为主要碳源，HCO3-→CO32-+OH-，放出大量的OH-，从而使pH升高；添加葡萄糖的培养液中，随葡萄糖添加量的增加，pH变化缓慢，这说明螺旋藻混合营养培养时优先利用葡萄糖，这与螺旋藻采用NaHCO3和葡萄糖作为混合碳源培养时优先利用葡萄糖的报道一致[8]。同时也发现，在螺旋藻光合自养及混合营养培养的过程中，pH从初始9.5逐渐升高到10.42，如此高的pH抑制了杂菌的生长，从而使螺旋藻光合自养及混合营养培养基不灭菌培养可行。

2.3 培养液污染检查

分别对上述培养液进行污染检查，发现均未污染，经显微镜观察发现藻体排列规律，未发现异形物，肉眼观察颜色墨绿，螺旋藻长势良好，这也证明了采用不灭菌Zarrouk培养基添加葡萄糖混合营养培养螺旋藻是可行的。

2.4 影响机理分析

蓝细菌是通过主动运输的方式摄入外源有机底物，葡萄糖进入蓝细菌不是一个容易的过程。葡萄糖在进入蓝细菌细胞后主要是通过磷酸戊糖途径被蓝细菌细胞利用，直接参与构成细胞成分，参与螺旋藻细胞的分裂。葡萄糖进入细胞后首先在葡萄糖激酶的作用下发生磷酸化反应，继而参与到各个代谢过程中去，葡萄糖激酶是细胞进行葡萄糖代谢的第一个关键酶。螺旋藻混合营养生长时，被利用的葡萄糖既作为细胞生长的能源，又作为细胞生长的碳源，甚至葡萄糖本身或葡萄糖的某一种间接代谢产物还有可能成为细胞生理的调节和刺激物质，因此外源葡萄糖的存在不可避免的对细胞的生理和代谢产生影响，使整个细胞处于比较活跃的生理状态[9]。现在进一步研究发现，混合营养条件下细胞葡萄糖激酶的活力明显高于光合自养条件下的葡萄糖激酶的活性，有机碳源被微藻细胞摄入后，将参与到细胞的代谢，有机碳源的利用会影响细胞初级代谢的流动状况，与光合自养过程相比，混合营养生长过程中，磷酸戊糖途径氧化性分支的反应过程明显加强，并随着培养的进行，有机碳源被细胞用作碳源的比例可能减小，而用作能源的比例有所增加。蓝细菌细胞中由于缺少α—酮戊二酸脱氢酶和琥珀酰辅酶A合成酶，三羧酸循环被认为是不完全的，葡萄糖的氧化释放CO2弥补了气体碳源CO2供应的不足，并可能使细胞在碳源利用中所消耗的ATP和NADPH有所节省[10]，因此在混合营养培养的条件下，光合反应速率增加、光饱和值升高、暗呼吸和光补偿点也显著提高，藻生物量浓度较光合自养有很大程度提高。

3 结论

研究了葡萄糖对螺旋藻生长的影响及机理分析，结果表明：3.0 g/L的葡萄糖浓度是支持该藻株混合营养分批培养的最佳浓度，并且采用不灭菌Zarrouk培养基混合营养培养螺旋藻是可行的。影响的可能机理是：外源葡萄糖的存在不可避免的对细胞的生理和代谢产生影响，使整个细胞处于比较活跃的生理状态，影响细胞初级代谢的流动状况。与光合自养过程相比，混合营养生长过程中，磷酸戊糖途径氧化性分支的反应过程明显加强，并随着培养的进行，有机碳源被细胞用作碳源的比例可能减小，而用作能源的比例有所增加，葡萄糖的氧化释放CO2弥补了气体碳源CO2供应的不足，并可能使细胞在碳源利用中所消耗的ATP和NADPH有所节省，最终导致螺旋藻光合反应速率增加、光饱和值升高、暗呼吸和光补偿点也显著提高，藻生物量浓度较光合自养有很大程度提高。

[1]Marquez F J,Sasaki K,Kakizono T,et al.Growth characteristics of Spirulina platensis inmixotrophic and heterotrophic conditions[J].J Ferment bioeng,1993,76(5):408-410

[2]张义明,陈锋,郭祀远.光照度及葡萄糖浓度对螺旋藻生长的影响[J].华南理工大学学报:自然科学版,1996,24(2):141-145

[3]张义明,陈峰,郭祀远.混合营养培养中光照强度及有机碳源对Spirulina platensis生长的影响 [J].贵州工学院学报,1996,25(4):82-89

[4]张义明,邱树毅,袁建平.钝顶螺旋藻在不同培养条件下的生长及其色素含量[J].贵州工业大学学报,1998,27(4):87-90

[5]郑江.葡萄糖和乳糖对钝顶螺旋藻生长和色素含量的影响[J].植物生理学通讯,2007,43(3):435-437

[6]史成颖,唐欣昀,甘旭华,等.有机碳氮源对钝顶螺旋藻生长及叶绿素a含量的影响[J].安徽大学学报:自然科学版,2005,29(5):92-96

[7]Zhang Y L,Li H Q,Gao J,et al.New process for separation and purification of polysaccharide from Spirulina Platensis[J].Food and fermentation industries,1999,25(2):15-18

[8]Lee Y K,Ding S Y,Hoe C H,et al.Mixotrophic Growth of chlorella sorokiniana in outdoor enclosed photobioreactor[J].Appl Phycol,1996,8:163-169

[9]郭宝江,庞启深.螺旋藻多糖对植物细胞辐射遗传损伤的防护效应[J].植物学报,1992,34(10):809

[10]史成颖.影响螺旋藻生长的理化因子[D].安徽农业大学2003届硕士论文,2003:47-48

Influence of Glucose on the Culture of Spirulina platensis and Mechanism Analysis

TIAN Hua1,YU Fei2,WANG Jin-ping3
（1.College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000，Henan,China;2.College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,Henan,China;3.Department of Biotechnology,Xingyang Agricultural College,Xinyang 464000,Henan,China)

2011-12-14

河南省科技厅科技发展计划项目（112102210309）；河南省教育厅自然科学研究计划项目（2011B180051）；信阳师范学院青年骨干教师资助计划

田华（1979—），女（汉），讲师，在读博士，研究方向：生物技术。