响应面法优化樟芝真菌发酵培养条件研究

孙素华，孙金旭，朱会霞，巩建英，刘艳立

（1.衡水学院，河北衡水053000；2.衡水中学，河北衡水053000）

响应面法优化樟芝真菌发酵培养条件研究

孙素华1，孙金旭1，朱会霞1，巩建英2，刘艳立1

（1.衡水学院，河北衡水053000；2.衡水中学，河北衡水053000）

借助于SAS8.0软件，对樟芝真菌进行发酵工艺条件的优化研究。首先利用Plackett Burman试验设计筛选出影响樟芝真菌发酵的3个主要因素，即接种量、培养温度和葡萄糖添加量。在此基础上用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，再利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析。结果表明，接种量与樟芝菌体产量存在极显著的相关性，通过求解回归方程得到优化主要发酵条件，接种量15%、培养温度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。经培养验证，预测值与验证试验平均值接近，此优化条件下樟芝菌体产量可达到7.06 g/L。

樟芝真菌；发酵；生物量；响应面

Abstract:With SAS8.0 software,the use of Plackett-Burman experimental design method and response surface method analysis of a fermentation of antrodia camphorata.Optimization of process conditions.First of all,the use of Plackett Burman screening experimental design affect antrodia camphorata production three main factors,namely,inoculum size,incubation temperature and glucose addition.On this basis the most steep climbing path in response to approaching the largest region,re-use Box-Behnken experimental design and response surface method for regression analysis.The results showed that inoculum antrodia camphorata production and the existence of significant relevance,by solving the regression equation had been optimized main fermentation conditions.They were inoculum 15%,culture temperature 26.1℃,the volume of 3.9%glucose added.By cultivating authentication and verification test predictive value close to the average,the optimum conditions can be achieved antrodia camphorata yield 7.06 g/L.

Key words：antrodia camphorata；fermenting；biomass；RSM

樟芝的化学成分非常复杂，现代分离技术证实，樟芝含有防癌，抗癌，提高免疫力的生理活性物质的主要成分为多糖体和三萜类化合物[1]。樟芝多糖提中主要含有β-D-葡聚糖，它能够通过刺激巨嗜细胞，T淋巴细胞，B淋巴细胞等增强人体免疫功能，进而达到抗肿瘤的效果。由于樟芝是台湾特有的种，惟一的寄主是牛樟树[2]，随着科技的发展，应用的范围不断扩大，需求量急剧上升。目前人工的子实体栽培比较困难，采用生物技术方法利用液体发酵培养樟芝菌丝体，并利用发酵液提取樟芝多糖是目前最经济，最符合环保的方法[3]。本文根据樟芝真菌的生长特点，利用SAS8.0数据处理软件，以菌体为目的产物，对樟芝真菌发酵条件进行优化研究。

1 材料和方法

1.1 菌株

樟芝真菌：衡水学院生命科学系微生物实验室保藏。

1.2 培养基

斜面培养基（g/L）：马铃薯200.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 1.5，KH2PO43.0，VB10.01，琼脂 20.0，20%的土豆汁配制。

种子培养基（g/L）：葡萄糖30.0，黄豆粉10.0，酵母膏 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41.0，VB10.01，pH 8.0，蒸馏水配制。

发酵培养基：碳源为葡萄糖3.8%，氮源为蛋白胨0.4%，pH8.0，酵母膏

1.3 培养方法

1.3.1 种子液的培养

从25℃下培养8 d的斜面上用接种铲切1 cm2带培养基的菌体转入装有150 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，25℃、150 r/min培养3 d。

1.3.2 发酵培养

将种子以一定的接种量，接入装有一定量培养基的500mL三角瓶中，在25℃培养温度下、振荡培养8d。

1.4 检测方法

1.4.1 生物量菌体干重的测定

取一定量的发酵液，用已烘干并称重的滤纸过滤,用水冲洗至洗液不再带有发酵液颜色为止。在80℃恒温的烘箱中烘至恒重,在干燥器中冷却至常温,称重。

3500 r/min离心15 min，弃上清液，菌体用蒸馏水洗涤至无发酵液颜色，60℃烘干至恒重。称重。

1.4.2 樟芝多糖的定量检测

本研究采用苯酚—硫酸法。

1.5 Plackett-Burman设计筛选樟芝发酵条件的重要因素

Plackett-Burman（PB）设计法是一种两水平的实验设计方法，它试图用最少的试验次数达到使因素的尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究[4]，根据樟芝所需营养要素和发酵影响因素的一般规律，结合相关的文献报道和笔者的前期实验，本试验选用实验次数N=12的实验设计，对接种量（X1）、培养温度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、摇瓶转速（X7）、摇瓶装液量（X8）8个因素进行考察，分别对应于表中的8列，每个因素取两个水平，响应值为樟芝菌体产量（Y）。对实验结果进行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般选择可信度大于90%以上的因素作为重要因素。

1.5.1 Plackett-Burman设计因素水平表

Plackett-Burman设计因素水平表，如表1所示。

表1 Plackett-Burman设计因素水平表Table 1 The level of Plackett-Burman design factors

1.5.2 响应面分析实验设计优化樟芝发酵条件

本实验采用Box-Benhnken实验设计对樟芝发酵条件进行3因素3水平的响应面分析实验，包括12个析因试验和3个中心试验。实验设计如表2所示。

表2 响应面实验因素水平表Table 2 Levels of the variables in the Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman设计筛选樟芝发酵条件的重要因素

根据樟芝生长所需营养要素和发酵影响因素的一般规律，结合相关的文献报道和笔者的前期实验，本试验选用实验次数N=12的实验设计，对接种量（X1）、培养温度（X2）、葡萄糖用量（X3）、酵母膏（X4）、蛋白胨（X5）、KH2PO4（X6）、摇瓶转速（X7）、摇瓶装液量（X8）8个因素进行考察，分别对应于表中的8列，每个因素取两个水平，响应值为樟芝菌体产量。运用Statistical Analysis System（SAS）8.0软件分别计算各因素的菌体产量，并对各因素菌体产量进行t检验，选择置信度较高的因素作为显著因素作进一步考察。实验设计及实验结果见表3，各因素主效应分析结果见表4。

表3 Plackett-Burman实验设计与结果Table 3 Plackett-Burman experimental design matrix and theexperimental results

由表3、4及表3中因素的P值可以看出接种量、培养温度和葡萄糖用量这3个因素在α=0.05水平上对樟芝的菌体产量具有显著影响，其P值分别为0.04305、0.04997和0.03768，其他因素在α=0.05的水平上对其表达量的影响不显著。所以将接种量、培养温度和葡萄糖用量这3个因素进一步采用响应面法进行优化，以确定最佳发酵培养条件，而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。

2.2 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域[6]。由Plackett-Burman实验结果设计主要因素的最陡爬坡路径，其中接种量有显著正效应，应增加；培养温度和葡萄糖用量有显著负效应，应减小。根据这3个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行试验，设计及结果如表5所示。

表4 各因素的主效应Table 4 Levels of the variables and effect in Plackett-Burmandesign

表5 最陡爬坡实验设计及其试验结果Table 5 Points on the first path of the steepest ascent study

由表5可见，最优发酵条件可能在试验3与试验4之间，故以试验3的条件为响应面实验的中心点。

2.3 响应面分析实验设计优化樟芝发酵条件

依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验确定的实验因素与水平，采用Box-Benhnken实验设计对樟芝发酵条件进行3因素3水平的响应面分析实验，包括12个析因试验和3个中心试验。运用SAS软件的RSREG(Response surface regression)程序对15个试验点的响应值进行回归分析。15个试验点可分为两类：其一是析因点，自变量取值在各因素所构成的三维顶点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差，以樟芝菌体产量为响应值，经回归拟合后，确定函数表达式。试验结果见表6。

表6 Box-Behnken试验设计及相应结果Table 6 Box-Behnken design and the experimental results

该实验回归方程为：

采用SAS RSREG程序对表5数据进行ANOVA分析，结果见表7。

表7 回归方程中回归系数的估计值及方差分析Table 7 Results of the Box-Behnken design regression analysis

该方程回归显著，模型的复相关系数的平方即R2=99.27%，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小，可以用该方程代替真实实验点进行分析。由表6中的P值可知道，方程中X3对Y值的影响达显著水平，而方程中 X1、X1X1、X2X2和 X3X3对 Y 值的影响达极显著水平，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，这和模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。交互项系数均不显著，所以交互作用的影响相对较小。失拟项的P=2.116，没有显著性影响，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。

通过软件分析，得出当樟芝菌体量最大时，X1=-0.0267；X2=0.0626；X3=-0.0732 ，计算得到樟芝液体发酵工艺最佳条件为：接种量15%、培养温度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%。此条件下，樟芝菌体产量最大值为7.03 g/L。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化发酵条件进行发酵培养，实际测得的樟芝菌体产量为7.06 g/L，与理论预测值相比，其相对误差约为1%，因此，基于响应曲面法所得的樟芝发酵条件参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

实验证明响应面方法是优化发酵条件非常有效的工具，Plackett-Burman试验设计能对影响樟芝发酵的各因素进行评价并能有效地找出主要因，最陡爬坡法能充分接近最大响应面区域，Box-Behnken实验设计能建立主要因素影响樟芝菌体的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，找出最佳值。本研究经响应面方法优化，得出樟芝真菌的最佳发酵条件为：接种量15%、培养温度26.1℃、葡萄糖添加量3.9%，优化条件下经三批摇瓶培养实验验证，预测值与验证试验平均值接近，此培养条件下樟芝菌体产量可达到7.06 g/L。

[1]贾薇,刘艳芳,张劲松,等.樟芝深层发酵培养条件的优化[J].食品科学，2004，25(5):52-55

[2]ILEE I H,LING R,CHEN C T.Antrodia camphorate polysac-harides exhibit anti-epatitis B virus effects[J].FEMS Micro-iol Lett,2002,209(1):63-67

[3]吴其威,黄瑞珊.樟芝菌发酵产物中多糖组分的分离与性质研究[J].上海交通大学学报,1994,28(2):82-89

[4]Ahuja S K,Ferreira G M,Moreira A R.Application of Plackett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J].Biotechnology and bioengineering,2004,85(3):666-675

The Fermenting Condition of Culture Optimizing Study for Antrodia Camphorata Using of RSM

SUN Su-hua1,SUN Jin-xu1,ZHU Hui-xia1,GONG Jian-ying2,LIU Yan-li1
（1.Hengshui College,Hengshui 053000,Hebei,China;2.Hengshui High School,Hengshui 053000,Hebei,China）

2011-12-15

衡水学院资助课题（2008031）

孙素华（1970—），女（汉），副教授，硕士研究生，主要从事生物信息处理等方面的研究。