山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定

高清山，邢继德，魏怀生，鲁梅，燕淑海

（山东潍坊工程职业学院，山东青州262500）

山楂酿酒酵母的筛选及其发酵性能测定

高清山，邢继德，魏怀生，鲁梅，燕淑海

（山东潍坊工程职业学院，山东青州262500）

以山楂为原料,利用平板划线分离法，得酵母9株。利用杜氏小管实验对酵母进行筛选，获得4株发酵力较强酵母。将其进行酒精、酸度、糖度的耐受性试验，表明总体耐受性较好。将其与1450酿酒酵母共同进行发酵性能测定，确定了⑤号酵母是优良菌株。在60 mg/L SO2和28℃的条件下，可酿造出11.3（体积比）酒精度，3.0 g/L还原糖，8.1 g/L总酸度，0.21澄清度，酒色鲜红、口感纯正、香味浓郁的山楂干红酒。

山楂；酿酒酵母；筛选；发酵特性

Abstract:In this paper,9 strains of yeast were obtained by using hawthorn as raw material and using streak plate as separation method.Initially screened with Du-canaliculus experiments four strains of yeast with stronger fermentation capability were identified.Further tolerance testing on alcohol contents,acidity and sugar contents indicates that their overall performance of fermentation is better.Applied jointly with Saccharomyces cerevisiae No.1450,the No.⑤strain of yeast is determined to have the fermentation performance of excellent yeast.Under the conditions of 60 mg/L SO2and 28℃,the yeast can produce a wine with the following characteristics:alcohol 11.3(V/v),reductionsugar3.0g/L,totalacidity8.1g/L,clarity0.21,bright-red incolor,puretaste,andrichfragrance.

Key words：hawthorn;Saccharomyces cerevisiae;screening;fermentation characteristics

山楂，又称仙果，几乎含有水果的所有营养成分，18种氨基酸，特别是VC的含量较高，达到89 g，比苹果高17倍，比梨高30倍。其主要成分有：山楂酸、黄酮、VC。主要功能：健胃消食、减肥、降血脂血压、防衰老、增强肌体免疫力等。据《本草纲目》记载：山楂可消化饮食，消肉积症瘕及痰饮痞满吞酸、血瘀胀痛。据洪昭光《食物是最好的医药》介绍：山楂有很多的营养和医疗价值，常吃山楂制品能开胃消食，预防动脉粥样硬化，使人延年益寿，故山楂被人们视为“长寿食品”。

山楂的品种很多，其中，以青州的敞口山楂最为有名。据青州府志记载，距今已有500多年的栽培历史。敞口山楂果实扁圆形，果皮涂红，果点黄白色，密集，果皮较粗糙，无光泽，因萼筒大而深，萼片开张而成“敞口”。青州敞口山楂个大、质优，适于加工，抗逆性强，适应范围广，全国各地慕名到青州引种及购买者很多。近年来，由于深加工能力不足，青州山楂出现了相对的产大于销的状况，如何做好山楂果品的深加工，增加农民收入，使山楂增产又增收，一直是果农十分关注的问题。根据当前我国干红果酒走俏市场的有利形势，对山楂干红生产的工艺条件进行了探讨，必将对当地的经济建设起到很好的推动作用，提供一条解决“三农”问题的有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

青州山楂；白砂糖；麦芽；1450酿酒酵母。

1.2 仪器设备

SPX-250B-Z型生化培养箱：上海将来实验设备有限公司；手持糖度仪：上海晖创化学仪器有限公司；超净工作台；发酵管；GC7890F气相色谱仪：安捷伦科技有限公司；722S分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；全果榨汁机；杀菌设备；天平；显微镜等。

1.3 培养基

富集培养基：葡萄糖 5%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，FeSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，上述材料灭菌后加亚硫酸钠至30 mg/L。

分离培养基：酵母膏3 g，蛋白胨5 g，麦芽汁3 g，葡萄糖8 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121℃蒸汽灭菌20 min，pH自然。

麦芽汁发酵培养基：蔗糖20%，酵母膏1%，麦芽汁3g，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%。

山楂汁发酵培养基：取山楂汁，稀释调整成分，加入使发酵后生成15%（体积比）酒的白砂糖，加亚硫酸钠至 30 mg/L，调pH3.5。

1.4 方法

1.4.1 山楂酒酵母的富集培养以及初步分离纯化[1-3]

将成熟山楂捣碎放于无菌的三角瓶中，暴露于空气中自然发酵，当有气泡产生并闻之有酒味时，用无菌纱布过滤，取过滤果汁50 mL加入富集培养基中，28℃恒温培养2 d～3 d，得到增殖培养液。将富集培养好的菌种通过初步分离纯化得到单菌落。选取较大菌落，编号后分别接入富集培养基试管斜面上，28℃培养2 d～3 d，置于4℃冰箱中保存待用。

1.4.2 优良山楂酒酵母筛选试验[4-6]

1.4.2.1 山楂酒酵母的初筛

杜氏管发酵实验法：将活化传代的酵母接人带有杜氏管的麦芽汁（10°Brix）培养基中，28℃培养48 h，接种量为1.0×107cfu/mL。

1.4.2.2 酵母耐性实验

将菌种分别采用不同的乙醇浓度（4%、8%、12%、16%、20%）、pH（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）以及糖浓度（10%、20%、30%、40%、50%)的带有杜氏管的麦芽汁发酵培养基中，28℃培养3 d，选择产气好的菌株。接种量为1.0×107cfu/mL。

1.4.3 山楂酒酵母的复筛[7-9]

将初筛得到的耐性较好的酵母株接人山楂汁发酵培养基，将活化1450酿酒酵母后，作同条件对照试验。

检测方法：酒精度（以体积百分数计，%vol）采用气象色谱法；残还原糖（g/L）采用斐林法；酸度采用酸碱滴定法；澄清度采用分光光度计测定。

2 结果和分析

2.1 酵母菌株的分离[10-12]

富集培养后，经稀释以及划线分离后挑出具有典型酵母菌落特征的菌株,用显微镜观察形态特征，并经酵母生理生化特性鉴定为酵母的共9株。

2.2 杜氏管发酵实验

分离得到的9株酵母分别编号，进行杜氏管产气实验，培养5 d后结果如表1。

表1 杜氏管实验Table 1 Experiment of Du-canaliculus

由表1可知，发酵24 h，有大量气泡产生的菌株有1株（酵母⑤号），48 h发酵有大量气泡产生的菌株有3株（酵母①号、③号、⑧号），这4株菌都有酒香生成，保留这4株进行下一步筛选实验。

2.3 酵母耐受性实验

2.3.1 酵母耐乙醇能力测定[13]

山楂酒在发酵过程，随酒度不断增加，在糖度还没有下降到足够低的时候，高浓度的酒精会抑制酵母的发酵；或者由于外因的影响，发酵醪突然中止发酵的情况下，必须添加处理好的山楂汁重新启动发酵。因此，在这些情况下，酵母对较高酒精浓度发酵液的适应能力显得非常重要，表2为各种酵母在不同酒精浓度条件下的耐受情况。

表2 不同酵母的耐乙醇性结果Table 2 Alcohol tolerance results of different strains of yeast

由表2可以看出：4株酵母在12%的酒精度环境中，耐受性均较好，随着酒精度的提高，酵母⑧号对较高浓度酒精的耐受性大大降低，其余3株耐受性较好。

2.3.2 酵母耐酸碱度测定[14]

山楂汁的酸性比较大，一方面可抑制有害菌的生长，避免发酵期间有害菌的感染，另一方面要求生产菌种必须具有较好的耐酸性能。因此在山楂酒酵母选育中，进行酵母的耐酸性测试非常重要，表3为不同pH下的酵母发酵情况。

表3 不同酵母的耐酸性的测试结果Table 3 Acidity tolerance results of different strains of yeast

由表3中可以看出：4株酵母在pH为3.5的环境中，耐受酸性均较好，在较低的pH下，酵母①号和酵母⑧号菌的耐受性明显减弱，酵母⑧号菌尤为明显。

2.3.3 酵母耐糖度测定[15-16]

在酿造山楂酒过程中，为了得到较高的酒精度，便于酒的保藏，需要调整加入更多的蔗糖，而糖浓度的增加对酵母渗透性可能产生影响，因此，要对筛选菌株进行耐糖度测试，表4为不同糖度下的酵母发酵情况。

表4 不同酵母在不同糖度下的充盈用时Table 4 Results different yeast in different sugar degree of fillingtime

由表4可以看出：4株酵母在20%左右的糖浓度环境中，发酵性能较好。但是，糖浓度降低，杜氏小管充盈时间延长；糖浓度提高，对酵母的抑制作用增强；当糖浓度达到50%时，①号和③号酵母明显受到抑制，几乎丧失发酵功能；⑤号酵母的耐糖度性最好，⑧号酵母次之。

2.4 酵母发酵性能的测定[11-13]

选取成熟无霉变的山楂，去梗洗净，称量后去核打浆，稀释后，加入一倍体积量的4%的脱臭酒精软化水和10 mg/L的亚硫酸钠，根据17.5 g/L的糖可生成1度酒精的比例再加入使发酵后生成12%（体积比）酒精度的白砂糖，加亚硫酸钠至30 mg/L，调pH 3.5。将初筛得到的4株酵母、活化1450酿酒酵母分别以8%的接种量接人山楂汁发酵培养基，28℃静止发酵5 d后，测定酒精度、还原糖、总酸度、澄清度，表5为测定情况。

表5 不同酵母发酵性能测定情况Table 5 Fermentation performance measurement results of different strains of yeast

由表5可以看出：⑤和③号酵母产酒精量分别为11.3和10.2（28℃、体积比），说明此2菌株产酒精能力最好；1450酿酒酵母和⑤号酵母对还原糖的利用能力最好；各项指标综合显示：⑤号酵母酒体澄清度最好，酸度最低，口感好，香味重，是一优良菌株，可以用于山楂酒生产，各项指标显示性能优于1450酿酒酵母，命名为山楂一号酵母。

3 讨论

本试验结果表明，自然发酵山楂是分离筛选山楂酒酵母的良好材料，经过分离、初筛、复筛和发酵性能测定，山楂一号酵母在相同条件下起酵时间为最短的13 h，在4%~20%酒精环境中有很好的耐受性，最佳耐受糖度为30%左右，最适pH为3.5左右，在60 mg/L SO2和28℃的条件下，可酿造出11.3（体积比）酒精度，3.0 g/L还原糖，8.1 g/L总酸度，口感纯正、香味浓郁的山楂干红酒，证明山楂一号酵母适合酿造山楂干红酒。

本试验仅报道了山楂一号的分离筛选及初步测定，但对其菌种的生理生化特性、培养特征、16SrDNA序列分析、以及形态特征、表面结构和生化测定、细胞壁的成分分析尚未研究。另外，利用山楂一号酵母，对山楂干红生产工艺进行优化研究，找出适合当地山楂干红生产的最佳工艺尚需进一步研究[15-18]。

[1]王慧,张立强,刘天明,等.产地葡萄酒优良酵母株的筛选及鉴定[J].酿酒科技,2007(9):29-32

[2]李兰,许桂芳,张连苹.石榴酒酵母的筛选[J].酿酒科技,2010(11):197

[3]穆立峰,屈慧鸽.山葡萄酒酵母的选育[J].特产研究,1996(1):21-23[4]陈则华,李理,肖利民,等.分离菌株在荔枝果酒酿造中的应用[J].酿酒科技,2007(4):154

[5]王俊沪,杨丽娟,冯作山,等.优良香梨酒酵母的选育[J].酿酒,2003(6):26-28

[6]单艺,张兰威,崔宏斌.酵母菌的筛选及发酵特性研究[J].食品工业科技,2007(6):88-90

[7]苏畅,肖冬光,许葵,等.几种进口葡萄酒活性干酵母发酵性能比较,酿酒科技[J].2004(1):30-32

[8]申彤,陈红征,杨洁,等.哈密瓜酒产香酵母的筛选及特性研究[J].酿酒科技,2004(3):36-38

[9]赵芳.安琪牌葡萄酒活性干酵母在草莓酒酿造中的应用[J].中国酿造,2008(13):190

[10]陆琦,张穗生,吴仁志,等.三株甘蔗糖蜜酒精发酵高产酵母株的筛选[J].广西科学,2010,17(4):368-372,376

[11]陈瑶,赖崇德,刘玄,等.橙汁酿酒酵母株的分离筛选和发酵性能的测定[J].江西农业大学学报,2007(4):665-668

[12]冯作山,张维一.优良葡萄酒酵母的选育及发酵性能研究[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2000:4-6

[13]赵祥杰,涂国全.一株桑椹果酒酵母的分离筛选及耐性测定[J].酿酒科技,2007(1):28-32

[14]顾国贤,酿造酒工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,1996:245-270

[15]诸葛键,王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业出版社,1997:84-189

[16]吴国峰,李国全,马永强,等.工业发酵分析[M].北京:化学工业,2012:137-140

[17]罗富英,王宏,李再峰.荔枝全汁发酵果酒工艺研究[J].食品工业科技,2006,24(6):147-149

[18]Shay Y S,Ephraim P L,Ishak N.Antioxidant and eicosanoidenzyme inhibition properties of pom egranate seed oil and fermented juice flavonoids[J].Journal of Ethnopharmacology,1999,66(7):11-17

Screening of Hawthorn Saccharomyces Cerevisiae and Measurements of Their Fermentation Performance

GAO Qing-shan,XING Ji-de,WEI Huai-sheng,LU Mei,YAN Shu-hai
（Weifang Engineering Vocational College,Qingzhou 262500,Shandong,China）

2011-11-26

山东省高等学校科技计划项目（J10LC77）

高清山（1968—），男（汉），讲师，本科，硕士，主要从事应用微生物研究。