蛋白酶和纤维素酶协同水解豆渣的工艺

李琳，李海梅，何胜华，马莺

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

蛋白酶和纤维素酶协同水解豆渣的工艺

李琳，李海梅，何胜华，马莺*

（哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090）

采用碱性蛋白酶和纤维素酶协同水解豆渣制备发酵基料，并分析豆渣酶解液的成分。结果表明，豆渣与水以1∶4（质量比）的比例混合，调节豆渣液pH 7.0，添加碱性蛋白酶6000 U/g同时加入纤维素酶1.5%（以豆渣干重计），55℃水解4 h后，可用作发酵培养基制备豆渣发酵活性成分。

豆渣；水解；蛋白酶；纤维素酶

Abstract:The producing method of hydrolysates of soybean dregs were studied.Soybean dregs were dilluted with distilled water at 1∶4(weight ratio).After adjusted solution pH 7.0,hydrolyzed by 6000 U/g alcalase and 1.5%cellulase(dry soybean dregs)for 4 h at 55℃,the hydolysate can be used fertimentation culture for producing active ingredient.

Key words：soybean dregs;hydrolysation;protase;cellulase

豆渣是大豆分离蛋白、豆腐等大豆制品加工中的主要副产物，约占全豆干重的15%~20%。豆渣中碳水化合物含有约60%~70%的纤维素和15%~20%的蛋白质，以及多种微量元素和矿物质[1]。豆渣由于纤维含量高，纤维颗粒大，口感粗糙，同时还含有抗胰蛋白酶、皂素和血凝素等抗营养因子，不易被人体消化吸收，而且豆渣还含有令人难以接受的豆腥味。因此，作为食品原料的利用率较低，大多作为饲料和垃圾处理[2-3]。

采用选择性蛋白酶或者微生物发酵法可以制备多种性能的膳食性活性肽[4-5]，如降血压肽、降胆固醇活性肽、抗氧化肽、免疫调节肽、促进矿物质吸收等低分子（2个~9个氨基酸）和中等链长（20个氨基酸左右）的活性肽[6-7]。通过微生物和酶的作用可把豆渣中的膳食纤维微粒化，部分不溶性膳食纤维降解为水溶性多糖，增加可食纤维量，消除豆渣的粗涩感以及豆腥味，有效地改善大豆膳食纤维的功能性和应用价值[8-9]。

大豆膳食纤维和大豆活性肽是重要的食品工业原料和食品补充剂[10-11]，拟采用蛋白酶和纤维素酶协同水解豆渣作为霉菌发酵的底物[12]，研究确定酶解反应的适宜条件，为后续微生物生长提供适宜的底物。

1 材料与方法

1.1 材料

豆渣：哈高科大豆食品有限责任公司提供。

Alcalase2.4 LFG：诺维信（中国）产品，活力 2.6×105U/m L；风味蛋白酶（Flavourzyme500MG）：诺维信中国公司，活力5×104U/g；纤维素分解酶（工业应用）：诺维信中国公司；滤纸酶活2000 U/g。

1.2 仪器

754PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；FA1104型电子天平：上海精密仪器公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；101-1A型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PHS-3C型精密PH计：上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

豆渣成分分析方法：水分含量GB/T 5009.3-2003《食品中水分的测定》；灰分含量GB/T 5009.4-2003《食品中灰分的测定》；蛋白质含量GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》；脂肪含量GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》；淀粉含量GB/T 5009.9-2003《食品中淀粉的测定》。大豆蛋白水解度的测定方法茚三酮法。纤维素酶水解液测定DNS法。

底物浓度：由于豆渣酶解液是用于霉菌发酵的底物，根据豆渣在水中溶解特性，豆渣加水过多，酶解液浓度太低，对后续发酵液处理工艺不利，豆渣与水比例过小，酶解反应以及后续发酵时物料的传递性能差，既不利于酶解反应，同时对后续霉菌发酵过程也不利，通过预备试验验证，以湿豆渣与水比例为1∶4最佳，故在研究酶解时均以此比例进行研究。

豆渣和水（1∶4，质量比）室温下混合，首先调节pH至需要值，然后添加一定量的酶，在特定温度下水解某一时间后，高温灭酶，在离心机中8000 r/min离心10 min，得豆渣酶解液和未水解残渣供分析使用。

1.3.1 蛋白酶酶解条件的研究

主要研究酶的用量和酶解反应时间等条件对蛋白水解度的影响。寻求水解度DH＜10%，且苦味最低的最优酶解条件。

试验选用的两种蛋白酶的最适合温度和最佳pH参考酶产品的说明书最佳使用条件选择。考虑到后续工艺中将采用蛋白酶与纤维素酶同时对豆渣进行水解，因此，兼顾纤维素酶的最佳使用条件，两种蛋白酶酶解豆渣中蛋白质的工艺条件确定为：反应温度55℃，反应pH 7.0。

1.3.2 纤维素酶酶解条件的研究

在研究纤维素酶的使用条件时，同样需要考虑所选用的蛋白酶的使用条件，统筹考虑来确定纤维素酶的水解条件。豆渣和水（1∶4，质量比）室温下混合，调节pH 7.0，添加一定量纤维素酶，温度55℃下水解一定时间后，灭酶，8000 r/min离心10 min，得豆渣纤维素酶解液。主要研究加酶量与酶解反应时间对豆渣纤维水解的影响。

1.3.3 双酶（蛋白酶和纤维素酶）混合水解豆渣条件的优选

在本研究中，豆渣进行蛋白酶和纤维素酶水解的主要目的是为微生物发酵提供易于利用的营养物质，即酶解液中应含有单糖、氨基酸等小分子化合物。因此，只要能满足这一基本要求，酶解工艺应尽可能简单，这对工业化生产意义重大。

以豆渣为底物，研究蛋白酶和纤维素酶协同水解大豆蛋白和大豆纤维工艺条件时，拟将两种酶同时加入反应液中进行反应。这可极大缩短酶解反应时间，但要对两种酶的应用条件合理调整，确定酶解温度为55℃，pH控制在7.0，重点是研究酶的用量以及确定酶解反应时间。

2 结果与讨论

对试验所用的豆渣进行成分分析，结果见表1，从豆渣成分表可以看出，其主要成分是纤维和蛋白质，二者占总干物质85%以上。

表1 豆渣成分Table 1 Ingredient of soybean dregs %

2.1 蛋白酶酶解豆渣研究

分别研究了Alcalase碱性蛋白酶和风味蛋白酶不同加酶量及酶解时间对蛋白质水解度的影响，图1为Alcalase碱性蛋白酶的酶添加量与酶解时间对蛋白质水解度的影响。

随着反应时间的延长，水解度不断增加，反应时间超过6 h后，增加速率变缓，继续延长反应时间不利于提高生产效率，因此在实际应用中酶解反应时间不应超过6 h；虽然增加酶的使用量也使水解度增加，考虑到生产成本，酶的用量不应无限增加。在能满足工艺要求的前提下，尽可能选用低加酶量。

所用的风味蛋白酶不同加酶量及酶解时间对蛋白质水解度的影响如图2所示。

风味蛋白酶的酶解效果与碱性蛋白酶类似，酶量的增加和时间的延长都使豆渣中的蛋白质水解度增加。

比较两种蛋白酶的水解效果，在实验条件下得到的水解液均无苦味。在相同的加酶量和相同的反应时间，Alcalase碱性蛋白酶水解度高于风味蛋白酶。以加酶量2000 U/g，反应时间为4 h为例，Alcalase碱性蛋白酶水解度为6.6%，风味蛋白酶水解度只有3.8%，故选用Alcalase碱性蛋白酶为试验用酶。

2.2 纤维素酶酶解豆渣研究

重点研究不同加酶量及反应时间对水解液中还原糖含量的影响，图3给出了不同的加酶量在不同的反应时间后溶液中还原糖的变化情况。

从图3中可以看出，酶量的增加和时间的延长都会使溶液中还原糖的含量增加，但在实际应用中，酶量的增加将加大生产成本，时间的延长会降低生产效率。得到的酶解液在能满足后续发酵要求的前提下，反应时间应尽可能缩短，酶用量尽可能少。

采用性纤维素酶水解豆渣时，同时可以提高可溶性成分含量，豆渣可溶性纤维素酶解产物得率的计算方法：

式中：外加物质是指加入的酶及调节pH时加入的酸或碱。

图4显示的是不同的加酶量在不同的反应时间后，豆渣经纤维素酶分解后可溶性产物的得率。

酶量的增加以及反应时间的延长都会提高可溶性物质的产率，但随着反应时间的延长，提高速率变缓，因此反应时间不宜超过6 h。酶用量的成倍增加，并未使得纤维素酶的水解率也成倍增加，因此酶用量可减少些。

2.3 蛋白酶和纤维素酶协同酶解豆渣的研究

根据单一酶解的研究结果，寻求适合蛋白酶和纤维素酶两种酶都能适应的反应条件。

确定反应条件：豆渣和水（1∶4，质量比）室温下混合，调节pH 7.0，温度55℃。

添加Alcalase碱性蛋白酶6000 U/g和纤维素酶1.5%，水解一定时间后，灭酶，8000 r/min离心10 min，得豆渣双酶水解液。测定水解产物得率。

式中：外加物质是指加入的酶及调节pH时加入的酸或碱。

图5显示的是酶解时间与水解产物得率的关系。

从图5中可以看出随着反应时间的延续，豆渣水解的可溶性产物逐渐增多，但是反应超过4 h后增加速率变缓，从实际应用的角度出发，反应时间不宜过长，越短越好，以反应4 h为宜。

3 结论

将湿豆渣和水按1∶4（质量比）的比例室温下混合均匀，调节p H 7.0，在温度达到55℃时，同时加入碱性蛋白酶6000 U/g和纤维素酶1.5%，控制温度55℃，水解4 h灭酶终止反应。此工艺简单，由于蛋白酶和纤维素酶同时进行反应缩短反应时间，豆渣的水解度可达到9.03%。水解液中主要含有还原糖、氨基酸和肽类，达到预期目的，将此酶解液用作发酵原料将在后续的工作中继续研究。

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Hydrolysis of Soybean Sregs by Proteases and Cellulase for Fermentation Medium

LI Lin,LI Hai-mei,HE Sheng-hua,MA Ying*
（School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,Heilongjiang,China）

2011-12-28

黑龙江省“十一五”科技攻关项目（GA09B401-7）

李琳（1962—），男（汉），副教授，研究生，研究方向：食品加工。

*通信作者