酸败的马鹿初乳分离乳酸菌耐性研究

王晓文，岳喜庆，张俊伟，姜忠良

（1.沈阳农业大学食品科学院，辽宁沈阳110866；2.辽宁大学轻型产业学院，辽宁沈阳110036）

酸败的马鹿初乳分离乳酸菌耐性研究

王晓文1，2，岳喜庆1，张俊伟2，姜忠良2

（1.沈阳农业大学食品科学院，辽宁沈阳110866；2.辽宁大学轻型产业学院，辽宁沈阳110036）

从酸败的马鹿初乳中分离得到49株菌株，经革兰氏染色和接触酶试验及生理生化试验共计鉴定出12种乳酸菌，这些乳酸菌以中温型乳酸菌为优势菌。为鉴定马鹿初乳中乳酸菌对机体的适应能力，对这12种乳酸菌进行耐性试验，主要验证其对人工胃液、人工肠液的耐受性，结果表明其中的4株乳酸菌耐酸性较强，以13号菌耐酸性最强，这将为未来开发鹿乳酸奶提供可靠地理论依据。

马鹿初乳；酸败；乳酸菌；体外耐受试验

Abstract:49 bacterial strain was obtained from the lactic acid bacteria of rancid colostrum from Cervus elaphus and 12 of them was identified as lactobacillus by means of gram staining and enzyme contact test and the type of which is intermediate temperature.The tolerance experiment of the 12 strains of lactic acid bacteria was carried out to identify the adaptive capacity to the organism including the tolerance to the simulatedgastricfluid and the simulatedintestinalfluid.The resistance of 4 lactic acid bacteria of them to acid are stronger than the others and the No.13 is the strongest based on the results.These results will offer a reliable theoretical basis for the development of the Cervus elaphus yoghourt.

Key words：colostrum from Cervus elaphus;rancidity;lactic acid bacteria;tolerance experiment in vitro

马鹿（Cervus elaphus），是属于哺乳纲（Mammalia）偶蹄目（Artiodactyla）反刍亚目（Ruminantia）鹿科（Cervoidea）鹿亚科（Cervinae）鹿属（Cervus）的动物[1]，它的别名为赤鹿、红鹿、八叉鹿，是我国的国家Ⅱ级重点保护野生动物，同时还是重要的经济动物和其具有极重要的生态价值。马鹿的初乳为黄色、淡黄色或黄白色，异常地浓稠，黏性也很大，略带有碱味和微臭味[2]。这是因为动物的初乳（指产后1 d~3 d的乳）内含有丰富的球蛋白、清蛋白、免疫体、白细胞、酶、维生素和溶菌素等[3]。

益生菌，是指定植于人体肠道内，能够产生确切的健康功效的活的有益微生物总称。作为益生菌的双歧菌和乳酸菌，具有抗肿瘤、抑制有害微生物的生长、可以改善机体肠道内菌群的分布、调节机体胆固醇和乳糖的代谢，同时还可以促进机体对钙的吸收和维生素的合成等。益生菌必须具有一定耐受机体的特性，如能够耐受机体胃酸、耐受胆盐、在机体肠道中定植及对宿主的安全性等[4-7]。自从益生菌的益生作用被证实以来，具有益生性能的新的菌株就不断地被筛选和鉴定出来，同时也建立了许多在体外筛选益生菌方法[5，8-9]。本文从酸败的马鹿初乳中分离得到的乳酸菌进行耐性研究，以探讨其潜在的益生性。

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：辽宁省清原县养鹿场，为第2天的马鹿初乳。将采集后的马鹿初乳置于30℃恒温培养箱中进行培养，使其酸败。

培养基及试剂：MRS培养基，人工胃液，人工肠液[10]。

1.2 方法

1.2.1 温度耐受试验

参照周德庆[11]的乳酸菌鉴定方法，在 10、15、40、45、50、60℃30 min 6个温度梯度下，按2%的量接种供试菌液于5 mL经过滤、灭菌的MRS液体培养基中，每株菌在每一温度条件下设2个重复，并在各温度下设两管空白对照，于生化培养箱内培养2 d或冰箱内培养2 d～5 d。目测菌悬液的浑浊度，记录结果。

60℃30 min是指分离菌株接种后先在60℃恒温培养30 min，然后在37℃下恒温培养2 d。

1.2.2 pH耐受试验及耐酸性菌株的初步筛选

参照周德庆[11]的方法，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L HCl溶液调节pH，制成不同pH梯度的MRS液体培养基（液体培养基过滤），pH的参数（25℃测定）为 3.5、4.3、4.5、6.5、8.5、9.6，按 2%的接种量接种于供试菌液，每一菌株在同一pH条件下设两个重复，并在各pH梯度下设两管空白对照，置于37℃恒温培养48 h，以空白MRS液体培养基做对照，在600 nm波长处检测其吸光值。

1.2.3 耐受pH为3.0人工胃液乳酸菌菌株的筛选

取MRS乳酸菌的菌悬液0.5 mL与4.5 mL、pH为3.0的人工胃液混合后，置于37℃培养箱中培养，分别在开始（0 h）和3 h后取样品，测定其活菌数。

1.2.4 乳酸菌对人工消化液的耐受性测定

将筛选出的乳酸菌的MRS培养液经离心（3000 r/min，10 min）后收集其菌体，再用无菌生理盐水离心洗涤2次，使其菌体悬浮于5 mL无菌生理盐水中制成菌悬液。然后，将乳酸菌的菌悬液各0.5 mL分别接种于含4.5 mL过滤除菌处理的pH为2.0、3.0和4.0的人工胃液中，并置于37℃培养箱中培养，在开始（0 h）和培养1、2、3 h分别取样，测定其样品的活菌数。然后取在不同pH的人工胃液中已经消化了3 h的培养液0.5 mL，分别接种于4.5 mL过滤除菌的pH为8.0的人工肠液中，继续置37℃培养箱中培养，并分别在0、3、6、24 h 测定其样品的活菌数[12]。

1.2.5 发酵乳中的乳酸菌对人工消化液的耐受性测定

将供试乳酸菌，按2%（体积分数）的量接种于质量浓度为10 g/100 mL无菌脱脂乳中,置37℃培养箱中培养16 h后而制成发酵乳,分别吸取0.5 mL接种于pH 为 1.2、2.0、3.0、4.0和 5.0的 4.5 mL过滤除菌的人工胃液中，置于37℃培养箱中培养。分别在开始和培养1、2、3 h取样，测定其样品的活菌数。继而取0.5 mL已在人工胃液处理3 h的样品，接种于4.5 mL过滤除菌的pH为8.0的人工肠液中，继续在37℃培养箱中培养，分别在 0、3、6、24 h 测定其样品的活菌数[12]。

1.2.6 数据处理

以上试验分别3次独立试验，每次试验设3个重复。数据以X±sd形式表示，采用最小显著性方差分析，P=0.05。

2 结果与分析

2.1 温度耐受试验

将分离得到的12个菌株分别接种于MRS液体培养基中，在不同的温度下进行培养，观察其生长情况，其结果如表1。

表1 温度耐受性试验Table 1 Temperature tolerance experiment

表1表明，在低温的环境下，大部乳酸菌均不能生长，10℃培养时没有菌种可以生长，可见低温会抑制乳酸菌的生长，15℃培养时也只有13号和14号菌有一定的生长，但生长效果也不是很明显。40℃和45℃这2个温度下培养时大部分的乳酸菌都能生长，而且都能呈现出较强的生长趋势，所以这两个温度是乳酸菌生长的最适生长温度。而50℃培养时有些乳酸菌虽也能生长，但生长的效果不明显，由此可以判断分离出来的乳酸菌以中温型乳酸菌为优势菌（最适生长温度40℃）。

2.2 pH耐受试验

将分离得到的乳酸菌分别接种于不同pH的MRS液体培养基中，经培养后测定其菌悬液的吸光值，判断其生长的最佳环境。测定生长后将吸光值绘制如图1曲线。

图1表明，这12株乳酸菌对不同pH的耐受能力有所不同。菌株在pH为3.5、4.3、4.5时，生长情况较差或者说几乎不生长，而在中性（pH 6.5）或在偏碱性（pH 8.5）的条件下均可以生长，但在碱性条件下时生长效果并不是很好。所有菌种在pH为6.5时生长效果最佳，由此可以判断乳酸菌的最适pH为6.5。

2.3 耐受pH为3.0人工胃液乳酸菌菌株的筛选

从自酸败的马鹿初乳中分离的12株乳酸菌，经过在pH为3.5的MRS液体培养基的生长和其在pH为3.0人工胃液中的存活率如表2所示。

表2 酸败的马鹿初乳分离乳酸菌在pH为3.5及pH为3.0人工胃液中的生长情况Table 2 The growth of lactic acid bacteria separated from the rancid colostrum of Cervus elaphus in artificial gastric(pH=3.5 and pH=3.0)

表2说明，在分离出的12种乳酸菌中，其中13、14、21、22、25、29、35、47 号菌株有一定的耐酸性，而在pH为3.0人工胃液中的存活率达50%只有4种，为13、29、35、47 号菌株。

2.4 乳酸菌对人工消化液的耐受性试验

将以上得到的4株菌株经过pH为2.0，3.0和4.0的人工胃液消化3 h后，再分别接入pH为8.0的人工肠液，消化0、3、6、24 h后活菌数的变化如表3所示。

表3 耐酸性乳酸菌在人工胃液和肠液中消化后的存活数Table 3 The survive number of lactic acid bacteria which resistant to acid in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表3结果表明，这4株乳酸菌具有较强抗人工胃液消化能力，在pH为3.0和pH为4.0的人工胃液中持续消化3 h后其活菌数量不仅没受影响，而且数量略有增加，其中13号菌株表现尤其明显。这4株菌株经过不同pH人工胃液消化后再进入人工肠液消化24 h后，仍能保持较高数量的活菌，这一结果说明它们均对人工肠道消化液具有很好的耐受性。

2.5 发酵乳中的乳酸菌对人工消化液的耐受性测定

将13号菌接种于10%的无菌脱脂乳中，置37℃培养箱中培养16 h后，制成的发酵乳按1∶9比例与不同pH的人工胃液混合在37℃恒温箱中消化3 h并进入人工肠液消化24 h后活菌数的变化见表4。

表4 13号菌制作的发酵乳在人工胃液和肠液中消化后的存活数Table 4 The survive number of fermented milk made by the bacterium of No.13 in the artificial gastric juice and intestinal juice for digestion

表4结果表明，发酵乳中的13号菌在pH为1.2的人工胃液中消化3 h后活菌数几乎已经检测不到；而在pH为2.0，3.0，4.0和5.0的人工胃液中消化3 h后，其存活数量几乎未受影响。进入pH为8.0的人工肠液消化3 h和6 h后，活菌数变化不大，消化24 h后活菌数略有降低。发酵乳中的乳酸菌对人工胃肠液的耐受性显著要高于单纯菌液，这是由于乳中的成分对人工消化液起缓冲作用及对菌体保护作用所致。

3 结论

1）从辽宁省清原县养鹿场得到的马鹿初乳酸败后分离出的12株乳酸菌中其优势乳酸菌为40℃生长良好的中温型乳酸菌。

2）分离得到的13号乳酸菌为乳杆菌，从其耐酸性上来看马鹿初乳中乳杆菌的耐酸性要比乳球菌的耐酸性要强。

3）在pH为3.0人工胃液消化3 h后，存活率最高的菌株为13号株为乳杆菌其存活率为99%。各菌株在不同pH的人工消化液中其生存率的高低呈菌株依赖性和pH依赖性。13号菌株对人工肠液也有很好的耐受性。将13号菌株制成发酵乳后，其对人工胃消化肠液的耐受性要明显高于单纯菌体，这是由于乳中蛋白质对消化液起缓冲作用和对菌体起保护作用所致。

[1]侯扶江,常生华,于应文.我国鹿况简介[J].草业科学,2003(11):47-50

[2]周小鸾.母鹿初乳的抽取与哺喂[J].特种养殖,新农村,2003(3):16

[3]赵世瑧.如何抽取母鹿初乳[J].特种养殖,中国农业科技,2000(4):26

[4]Fuller R.Probiotics[M]//The scientific basis.New York:Chapman and Hall,1992:398

[5]Marteau P,Minekus M,Havenaar R,et al.Survival of Lacticacid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine:validationandtheeffectsofbile[J].JDairySci,1997,80:1031-1037[6]DE SMET I,VAN HOORDE L,Vande woestyne M,et al.Signifi cance of bile salt hydrolyticactivities of Lactobacilli[J].Journal of applied bacteriology,1995,79:292-301

[7]Lankaputhra W E V,Shah N P.Survival of Lactobacillus acidophilusand Bifidobacterium spp in the presence of acid and bile salts[J].Cult Dairy Prod J,1995,30:2-7

[8]Pettersson L,Graf W,Alm L,et al.Survival of Lactobacillusacidophilus NCDO 1748 in the human gastrointestinal tract.1.Incubation with gastric juice in vitro[J].Symposia of the Swedish Nutrition Foundation,1983(15):123-127

[9]Kimoto H,Omurai M,Obayashi M,et al.Identification andprobiotic characteristics of Lactococcus strains from plant materials[J].Japan agricultural research quarterly,2004,38(2):111-117

[10]张和平,孟和毕力格,王俊国,等.分离自内蒙古传统发酵酸马奶中L.casei Zhang潜在益生特性的研究[J].中国乳品工业,2006,34(4):4-10

[11]周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986:56-59

[12]光冈知足.発酵微生物研究部特辑[M].ョーグルト用乳酸菌の効用,1994:3-1

The Study of the Tolerance of Lactic Acid Bacteria Separated from Rancid Colostrum of Cervus Elaphus

WANG Xiao-wen1,2,YUE Xi-qing1,ZHANG Jun-wei2,JIANG Zhong-liang2
(1.College of Food Science,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,Liaoning,China;2.College of Light Industry,Liaoning University,Shenyang 110036,Liaoning,China）

2011-12-13

王晓文（1970—），女（汉），在读硕土研究生，讲师，研究方向：动物性食品研究。