UPLC-MS/MS 法分析茶叶中的灭多威农药残留

郭灵安，雷绍荣，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省农业科学院分析测试中心，农业部食品质量监督检验测试中心，四川成都610066）

UPLC-MS/MS 法分析茶叶中的灭多威农药残留

郭灵安，雷绍荣，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省农业科学院分析测试中心，农业部食品质量监督检验测试中心，四川成都610066）

建立了检测茶叶中灭多威残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC－MS－MS）分析方法。茶叶样品经乙腈提取，氨基固相萃取柱净化，反相液相色谱对样品进行分离，采用多反应监测模式（MRM）进行定性、定量分析。结果表明：方法检出限为 0.5 μg/kg，定量限为 2.0 μg/kg；当添加浓度水平为 10、100 μg/kg 时，加标回收率为 71.9%～113.5%，相对标准偏差为5.3%～12.5%。该法灵敏度高、干扰小、定性准确，适用于茶叶中灭多威残留检测，同时可作为液相色谱检测的验证方法。

UPLC-MS/MS；茶叶；灭多威；残留

Abstract:A method was developed for the determination of methomyl residues in tea with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS-MS).The methomyl residues in tea samples were extracted with acetonitrile,the extract was cleaned up by amino solid phase extraction column,then separated by reversed phase liquid chromatography,and determined by UPLC-MS-MS in the multiple reaction monitoring mode.The results showed that:the LOD is 0.5 μg/kg,LOQ is 2.0 μg/kg;when the added level was 10,100 μg/kg,the recovery was from 71.9%-113.5%,and the relative standard deviation was from 5.3%-12.5%.The method can be used as the detection method and also the verification method for HPLC of Methomyl residues in tea,because of high sensitivity,low interference,and accurate qualitative.

Key words：UPLC-MS/MS;tea;methomyl;residues

近日，茶叶中农药残留超标和使用违禁药物的报道备受关注，消费者对食品安全问题再度产生热议。媒体报道国际环保组织（绿色和平）调查报告称，有多个国产品牌茶叶含有国家明令禁止在茶叶上使用的农药灭多威。灭多威被世界卫生组织（WHO）定义为剧毒农药，中毒症状有头晕头痛，严重者会出现血压下降或意识不清，长期暴露于该农药中会破坏人的内分泌系统。灭多威是20世纪60年代中期出现的氨基甲酸酯类（NMCs）杀虫剂。该类农药是以甲酸酯为前体化合物发展而来的，具有分解快、残留期短、低毒、高效、选择性强等特点，在农作物保护中的使用越来越广泛[1-3]。

伴随生活水平和健康意识的提高，人们越来越重视农药残留问题。早在2011年9月与12月，欧盟两次出台法规，强化对中国输欧茶叶的口岸抽检力度。此外，欧盟近年密集出台茶叶农残限量标准，使得输欧茶叶市场准入资格日益严苛，农残检出率大大提升。欧盟对农残标准的高要求，也导致了中国茶叶出口受到影响。

随着农药残留分析方法的发展与进步，人们已经对不同介质（如水、水果、蔬菜、小麦、烟草、茶叶等）中氨基甲酸酯类农药测定进行了相关的研究[2-12]。其中，茶叶基质的检测方法有气相色谱法和液相色谱柱后衍生荧光法[11-12]，较为普遍的是液相色谱柱后衍生荧光法，其不足在于衍生试剂易氧化失效造成衍生效果不稳定，影响检测结果。而且茶叶复杂基质中大量干扰成分使液相色谱的分离也存在一定的困难，影响定性的准确性。LC-MS-MS是快速发展的一种分析技术，具有很高的灵敏度和分离能力，近年来在水果、蔬菜等农残分析上已有了一些应用，但在茶叶中农残分析的应用还鲜有报道。因此，建立一个茶叶中灭多威残留的液相色谱-串联质谱（LC－MS－MS）分析方法对于茶叶复杂基质中微量农药残留的检测实属必要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶为干样，粉碎备用；灭多威标准物质（标准溶液，浓度1000 μg/mL，农业部环境质量监督检验测试中心）；甲醇（HPLC，美国 SIGMA-ALDRICH）；乙腈（HPLC，美国 SIGMA-ALDRICH）；二氯甲烷（HPLC，美国 Honeywell Burdick&Jackson）；氯化钠（AR，汕头市西陇化工厂有限公司）；氨基固相萃取柱（6 mL，500 mg，美国 Agilent Accubond NH2）；试验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪：美国Waters；R-210旋转蒸发仪：德国BUCHI；培英THZ-C恒温振荡器：大仓市实验设备厂；DT-1002A电子天平：常熟市金羊砝码仪器有限公司；微孔滤膜：0.22 μm，天津津腾；实验室超纯化水机：艾科浦，ACD1-2005-U。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

吸取灭多威标准溶液（浓度1000 μg/mL）1mL于10 mL刻度试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成100 μg/mL的灭多威标准储备溶液。移取0.1 mL该标准储备液于10 mL刻度试管中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成1.0 μg/mL的灭多威标准工作液。上机标准使用液用前根据需要用甲醇、水的混合溶液（50+50）稀释成适当浓度。基质标准使用液用阴性空白样品溶液稀释成适当浓度。

1.3.2 样品制备和提取

称取5 g试样（精确至0.01 g）于磨口锥形瓶中，加入20 mL水，振摇，使茶叶充分润湿，静置溶胀20 min，加入50 mL乙腈提取液，置于振荡器上振荡1 h，过滤，滤液收集到装有约5 g氯化钠（氯化钠用前于140℃烘烤4 h）的50 mL具塞量筒中，盖上塞子，震摇1 min，室温（25℃）静置2 h。吸取10 mL上层清液（乙腈相）于100 mL梨形瓶中，40℃水浴旋转蒸干，加入3.0 mL淋洗液（甲醇+二氯甲烷=5+95）溶解残渣，盖上塞子待净化。

1.3.3 SPE净化

将氨基SPE小柱用4.0 mL淋洗液预淋洗，弃去淋洗液，当液面快到达柱吸附层表面时，将待净化样品溶液转移至SPE小柱中，收集流出液于50 mL梨形瓶中，再用淋洗液洗涤装样液的梨形瓶3次（3+2+2 mL），并转至SPE小柱，合并淋洗液。淋洗液于30℃水浴旋转蒸发至近干，洗耳球吹干，用甲醇、水的混合溶液（50+50）准确定容至2.0 mL，涡旋使之溶解完全，用0.22 μm的滤膜过滤，待测。

添加回收实验前处理同空白样品。即将标准物质添加到样品，静置0.5 h后以同样的方法提取净化。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：Waters BEH C8（2.1 mm ×50 mm,1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 μL。流动相 A：水，流动相B：甲醇+乙腈=1+1，梯度洗脱，流动相梯度见表1。

表1 流动相梯度表Table 1 The mobile phase gradient table

1.3.5 质谱条件

电喷雾正离子模式（ESI＋）；多反应监测MRM；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：150℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：700 L/h。质谱检测参数见表2。

表2 灭多威质谱参数Table 2 MS parameters of methomyl

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

文献报道的提取溶剂有丙酮、石油醚、丙酮/水[2]混合溶剂等。但茶叶基质成分多，用丙酮提取时，提取出的杂质较多，易造成基质干扰。而用乙腈提取，杂质少，净化后样品干净，分析结果的灵敏度、准确度更高。本研究选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 提取条件的优化

茶叶样品提取液浓缩时易产生暴沸，导致样品损失，回收率低。经试验发现，提取前需加入足够量的水分使之充分润湿，并放置一段时间。本实验中确定，称取5 g样品量时，加入20 mL水润湿样品能够明显减少暴沸的发生。同时为了保证茶叶中农药提取充分，将提取溶剂体积确定为样品质量的10倍。

2.1.3 净化条件的选择

氨基SPE柱的主要作用力是极性阴离子交换，与极性化合物有较的强结合能力，能将样品中的灭多威残留吸附在填料上，最后用中等极性洗脱体系（甲醇+二氯甲烷=5+95）将分析物洗脱下来，色素等杂志保留在SPE小柱上，从而达到净化、浓缩的目的。

2.2 仪器条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化

根据以往研究经验初步确定色谱条件，并进行优化，试验中采用梯度洗脱，能得到比等度条件下更窄的峰形，而且一定时间高浓度有机溶剂的洗脱能够减少色谱柱中杂质的残留，有利于延长色谱柱的寿命。

2.2.2 质谱参数的选择

灭多威极性较大，易离子化，适合采用ESI源。其含有的氨基甲酰基-OCONHCH3是一个给电子基团，容易得到一个质子，故容易在正离子模式下得到更多的离子，获得响应[13]。本实验采用直接进样方式，在ESI+模式下找到母离子，然后通过调节碰撞能量选择2个相对丰度较高的特征离子作为定量离子和定性离子（如表2所示）。分析时再结合化合物保留时间等信息，进行定性、定量分析。灭多威标准样品及样品加标离子色谱图见图1、图2。

从茶叶空白样品加标色谱图（图2）可以看出，在串联四级杆多反应监测（MRM）模式下进行检测，所选的定量离子和定性离子具有很高的特异性，经过SPE小柱净化处理后的样品对灭多威目标物质的分析基本不存在干扰。

2.2.3 基质效应的影响探讨

液相色谱-串联质谱检测时普遍存在基质效应问题，当样品中的共提取物与被测物一同进入质谱系统，将在一定程度上影响被测物的离子化过程，造成响应信号的抑制或提高[9]。本文对纯溶剂标准溶液和基质标准溶液进行比较，结果显示：茶叶基质对灭多威农药的离子化有明显的抑制作用，使得灭多威在样品基质中的质谱响应值降低了很多，如图3所示。所以，在定量分析中，要获得较为准确的分析结果，标准溶液和样品溶液必须在同样的基质条件下进行分析，即用空白茶叶基质配制的标准溶液对样品进行定量，以尽可能地消除或有效降低基质效应的影响。

2.3 方法检出限、定量限及添加回收试验结果

试验分别以仪器3倍信噪比和10倍信噪比求得方法检出限达0.5 μg/kg，定量限达2.0 μg/kg。选取2个茶叶样品进行检测，并做了加标回收试验。添加水平及回收率结果见表3。

表3 灭多威添加回收率与相对标准偏差(n=3)Table 3 The spiked recoveries and RSD of methomyl(n=3)

分析结果表明，所选特征离子反映出了分析物质的主要特征，灵敏度高，选择性好，定量分析准确。

3 结论与讨论

实验证明，采用液相色谱-串联质谱法分析茶叶中的灭多威农药灵敏度高、干扰小，定性准确，相对液相色谱荧光柱后衍生法也更加简便，尤其是对微量残留检测具有很大的优势。该法适用于茶叶中的灭多威残留检测，同时可作为液相色谱检测的验证方法。但需要注意的是，茶叶基质复杂，基质对电离有明显的抑制作用，如果用试剂标准溶液进行定量分析，回收率低，结果不可靠。因此在定量分析时，必须用基质空白配制标准溶液进行定量分析，以保证结果的准确性和可靠性。另外，测定样品的定容溶剂用甲醇和水的混合溶液可以降低溶剂效应，使色谱峰形得到改善，有利于准确定量。

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Analysis of Methomyl Pesticide Residues in Tea by UPLC-MS/MS

GUO Ling-an,LEI Shao-rong,ZHONG Ling-li,HU Li,LIANG Li,MAO Jian-fei
（Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Food Quality Inspection and Supervision Center of Agricultural Ministry,Chengdu 610066,Sichuan,China）

2012-04-24

郭灵安（1962—），男（汉），副研究员，学士，研究方向：食品质量安全。