高效液相色谱法测定甲鱼油中EPA、DHA的含量

赖春华，李军生，廖永聪，廖诚珍，谢志扬，陈铁英

（1.广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006；2.贵港市水产技术推广站，广西贵港537100；3.柳州市产品质量监督检验所，广西柳州545006）

高效液相色谱法测定甲鱼油中EPA、DHA的含量

赖春华1，3，李军生1，*，廖永聪2，廖诚珍2，谢志扬2，陈铁英3

（1.广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006；2.贵港市水产技术推广站，广西贵港537100；3.柳州市产品质量监督检验所，广西柳州545006）

建立分离检测广西黄沙鳖甲鱼油中的EPA和DHA的高效液相色谱法。试验采用岛津VP-ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇和水（体积比 70∶30），紫外检测波长为 254 nm ，流速为 0.7 mL/min，柱温为30℃。甲鱼油经0.5 mol/L KOH-乙醇溶液进行皂化，三乙胺-溴苯乙酮酯化后直接上机分析。结果表明：EPA、DHA在0.025 mg/mL~0.15 mg/mL范围内线性关系良好，R2EPA为0.9991、R2DHA为0.9995；该法用于甲鱼油的检测，回收率EPA为96.00%～98.67%，DHA为92.00%～98.00%，该法简便、快速、重现性好。

黄沙鳖；DHA和EPA；高效液相色谱；甲鱼油

Abstract:A high performance liquid chromatographic(HPLC)method was established for the determination of EPA and DHA in Chinese yellow sand soft-shelled turtle oil.The analysis was performed on shimADZU-PACK VP-ODS column (250 mm × 4.6 mm,5 μm)at the detection wave length of 254 nm.The mobile phase was consisted of methanol-water（volume ratio was 70∶30）as a flow rate of 0.7 mL/min at column temperature 30 ℃.The tutrle oil saponificatied by 0.5 mol/L KOH-ethanol solution and esterified by Triethylamine-αbromoacetophenone after analysis.The results showed that the calibration curve was linear in the concentration range of 0.025 mg/mL-0.15 mg/mL (R2EPA=0.9991,R2DHA=0.9995).The recoveries ranged from 96.00%to 98.67%for EPA and 92.00%-98.00%for DHA.The method was fast,simple and accurate.

Key words：Chinese yellow sand soft-shelled turtle;EPA and DHA;high performance liquid chromatography(HPLC);turtle oil

甲鱼，别名鳖、水鱼、团鱼和王八等，属爬行纲[1]，龟鳖目，鳖科，鳖属，甲鱼是我国传统的上等中草药材，具有极高的药用价值，是滋阴补肾的佳品，有滋阴壮阳，软坚散结、化淤和延年益寿的功能。甲鱼全身是宝[2]，其肉、甲、血、头、胆、卵、脂肪均可入药。甲鱼油来源于甲鱼的脂肪油，它富含ω-3多不饱和脂肪酸，主要包括[3]α-亚麻酸（α－linolenic acid，ALA）、二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）。具有多种生物学活性，是维系人类进化和健康长寿的重要物质[4]。具有保护视力、增智、健脑、抗癌[5]、降低胆固醇的作用和免疫功能[6]等生理功能。甲鱼油脂在体内分布较集中，易取得，脂肪含量高，完全可以单独加工成各种保健食品及保健药品[7]，以提高人们的生活水平及健康水平，且对甲鱼原有的利用不受任何影响，可谓一举两得，所以甲鱼脂肪开发利用前景广阔。多年来人们研究鱼油的EPA、DHA较多[8-12]，在甲鱼油方面的研究很少，金妙仁等[13]研究了甲鱼油的制备及其理化性质，本文对广西盛产的黄沙鳖甲鱼油中的EPA、DHA含量进行了测定，为深度开发和利用黄沙鳖甲鱼油的特殊营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黄沙鳖：广西贵港水产技术推广站提供。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

DHA和EPA（纯度大于99%）：Sigma公司；甲醇（色谱纯）：天津四友公司；水为双蒸水；溴苯乙酮（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；其它均为国产分析纯。

1.2.2 仪器

LC-10ATvp高效液相色谱仪（SPD-10Avp紫外检测器、LCsolution色谱工作站）：日本岛津；SZ-93自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：岛津 VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇—水（体积比70：30）；紫外检测波长：254nm；进样量：10 μL；流速：0.7 mL/min；柱温：30 ℃。

1.3.2 标准品的制备

分别准确吸取1 mg/mL的EPA和DHA标准溶液0.5 mL，用高纯氮气吹至近干，加入1滴酚酞指示剂，用0.1 mol/L KOH-乙醇溶液中和至终点，并再次用氮气吹干，此样品待酯化。

1.3.3 样品处理

取一定量的脂肪块，按照GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的测定方法》提取粗脂肪。准确称取0.0550 g甲鱼油样品，加入0.5 mol/L KOH—乙醇溶液4 mL，充氮气后在60℃水浴中加热30 min，冷却后加入l滴酚酞指示剂，用盐酸一乙醇溶液中和至终点，离心分离定容10 mL，取上清液0.5 mL，用氮气吹干，此样品待酯化。

1.3.4 酯化

标准品和甲鱼油样品经上述处理后，加10 mg/mL三乙胺的丙酮溶液0.2 mL及10 mg/mL ω-溴苯乙酮的丙酮溶液0.4 mL，充入氮气，60℃水浴加热15 min，冷却后定容，为待测酯化物。

2 结果与分析

2.1 空白试验

由于实验是应用衍生法测定，在酯化后未经萃取就直接进样，因此得考虑准备过程中所加试剂是否影响待测物质的检出。在不加标准品和样品的情况下，对酯化后的溶剂进行空白实验，判断干扰成分。所得的色谱图如图1。

2.2 流动相的选择

实验的流动相为甲醇和水，通过调节不同比例流动相来选择最佳分离条件。通过甲醇和水的比例为：85∶15；80∶20；75∶20；70∶30；65∶35，结果发现，当 V甲醇∶V水＝70∶30，流速为 0.7 mL/min 时，EPA 和 DHA 分离完好，色谱峰尖锐。结果表明，如图2、图3。

2.3 线性范围的考察及检出限

分别精密吸取 EPA：0.025、0.05、0.075、0.100、0.125、0.15 mg/mL 和 DHA 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL不同浓度的标准混合液进样，按上述条件测定峰面积，以标准品浓度为横坐标X、峰面积为纵坐标Y进行线性回归，得标准曲线。结果为：工作曲线Y=1.4×107X+2.6×105，R2EPA=0.9991；Y=6.9×106X+1.1×105，R2DHA=0.9995；表明在 0.025 mg/mL~0.15 mg/mL 浓度范围内，EPA和DHA线性关系良好。将标准溶液逐级稀释进样，测其峰高响应值及基线噪音强度，以3倍信噪比计算，EPA检出限为0.0015 g/L、DHA检出限为0.0027 g/L。

2.4 精密度实验

分别精密吸取一定浓度的EPA、DHA标准溶液10 μL，按1.3.1色谱条件，重复测定6次，测得峰面积并计算相对标准偏差，结果EPA和DHA的RSD分别为0.46%，0.67%。

2.5 重复性实验

精密吸取同一批甲鱼油样品6份，按1.3.3和1.3.4方法处理，同上述色谱条件，测定峰面积并计算相对标准偏差，结果EPA和DHA的RSD分别为0.36%、0.53%。

2.6 回收率的测定

取不同含量的甲鱼油样品4份，加入相同量的EPA和DHA，做加标回收。再取同一甲鱼油样品加入不同量的EPA和DHA，做加标回收，结果见表1、表2。

表1 不同样品相同加标量的回收率Table 1 Spiked recoveries of different sample with the same adder

2.7 样品的测定

用本法对黄沙鳖脂肪提取的甲鱼油，按样品处理的方法和色谱条件测定甲鱼油中EPA、DHA的含量，结果EPA、DHA含量分别为6.3%和5.6%。

3 结论

从本次实验数据结果来看，2种不同的加标方法：EPA回收率为96.00%~98.67%和96%~98%，DHA为97.00%~98.00%和92%~97%；EPA相对标准偏差为1.19和2.08，DHA为0.65和2.97。误差和回收率显示本方法可行，有效，简便、快速、重现性好。测得黄沙鳖脂肪块中含有约12%的EPA和DHA。

表2 同一样品不同加标量的回收率Table 2 Spiked recoveries of different adder with the same sample

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High Performance Liquid Chromatographic Determination of DHA and EPA in Turtle Oil

LAI Chun-hua1,3,LI Jun-sheng1,*,LIAO Yong-cong2,LIAO Cheng-zhen2,XIE Zhi-yang2,CHEN Tie-ying3
(1.Department of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China;2.The Fishery Technology Spread Station of Guigang,Guigang 537100,Guangxi,China;3.Liu Product Quality Supersion Testing Institute,Liuzhou 545006,Guangxi,China)

2011-11-18

广西贵港科学研究与技术开发计划项目（贵科软0906013）作者简介：赖春华（1985—），男（汉），硕士研究生，研究方向：食品生物化学。

*通信作者