怀地黄和怀山药混合提取多糖工艺优化

李超柱，陈艳辉，颜穆英，黄学仁，黄贵秋

（钦州学院，广西钦州535000）

怀地黄和怀山药混合提取多糖工艺优化

李超柱，陈艳辉*，颜穆英，黄学仁，黄贵秋

（钦州学院，广西钦州535000）

对怀地黄和怀山药混合提取多糖的工艺参数进行研究。通过考察提取温度、固液比、提取液pH、浸提液与乙醇添加量对怀地黄和怀山药混合提取多糖的影响，采用L9（33）正交试验，以多糖含量作为指标，确定混合提取多糖的最佳温度、pH、固液比。结果：怀地黄和怀山药混合提取多糖的最佳工艺参数为，浸提温度65℃、浸提液pH 5.0、固液比为1∶20（g/mL）、浸提液浓缩比为4∶1，沉降剂乙醇添加量6倍于浸提液体积，混合提取多糖率为44.78%。

怀地黄多糖；怀山药多糖；提取工艺

Abstract:This essay research on Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted process parameters.By examining the effect of extraction temperature,solid-liquid ratio,extracting solution pH,extract and ethanol adding to Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted,using the L9(33)orthogonal experiment,use an indicator of polysaccharide content to conform the mixed extract polysaccharide of the best temperature,pH,solid-liquid ratio.Result:Rehmannia and Huai yam mixed polysaccharide extracted optimal parameters as follows:extraction temperature of 65 ℃,extracts of pH 5.0,solid-liquid ratio of 1∶20(g/mL),the extract concentration ratio of 4∶1,the settlement agent ethanol add six times the volume of the extract;mixed polysaccharide extracted was 44.78%.

Key words：Rehmannia polysaccharide;huai yam polysaccharide;extraction process

怀地黄[Rehmannia glutinosa f.Yhueichingensis(Chan et Schih）Hsiao，简称 RG]为玄参科植物，是常用中药，始载于《神农本草经》列为上品。熟地是生地的炮制品，具有益精填髓、滋阴补血的功能。用于肝肾阴虚、目昏耳呜、腰膝酸软、骨蒸潮热、内热消渴、血虚痿黄、心悸怔仲、月经不调、崩漏下血、眩晕耳呜、须发早白等症。怀山药（Dioscorea opposite Thumb f.Yhueichingensis Hsiao，简称DT），又名山芋、菜山药，为薯蓣科多年生缠绕型草本植物，是营养丰富的药食同源植物，是中华民族传统的保健佳品，素有怀参之称。据本草纲目记载山药补虚羸,除寒热邪气，补中，益气力，长肌肉，强阴,久服耳目聪明,轻身延年。李时珍所著本草纲目中记载，山药有益肾气、健脾胃、止泻痢、化痰涎、润皮毛等功效。现代药理表明,怀地黄、怀山药具有多种生物活性，一般认为其主要活性成分是多糖。由于目前天然产物提取往往采用分别提取而忽略天然产物混合提取，而研究表明，怀地黄和怀山药混合提取一方面可提高得率，二方面有较好的药用效果，因此对天然产物混合提取的研究可将提高它们的经济效益[1-5]。

本试验通过综合考察温度、固液比、提取液pH、浸提液与乙醇添加量对怀地黄和怀山药混合提取多糖效果的影响，确定最佳提取工艺，为深入开展怀地黄多糖和怀山药多糖的综合利用提供理论参考。

1 材料和仪器

1.1 原料和试剂

怀地黄、怀山药：均购于钦州市农贸市场；乙醇、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚试剂：均为分析纯，购于南宁蓝天实验设备有限公司产品；浓硫酸为优级纯。

1.2 仪器

LB610型电子天平：上海上天精密仪器有限公司；SP-2000UV型紫外可见分光光度计：上海第三分析仪器厂；RE-5299A旋转蒸发仪：上海笠化仪器设备有限公司；FW－100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。

2 方法

2.1 标准曲线的绘制

精确称取干燥的无水葡萄糖 (105℃干燥至恒重)标准品25.3 mg，于500 mL容量瓶中加蒸馏水定容。分别精确吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL标准液于比色管中，各加蒸馏水至2.0 mL，再分别加入6%苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5 mL，迅速振荡均匀，室温显色40 min。另取1 mL蒸馏水，加入等量苯酚溶液和浓硫酸，作为空白对照，将上述试样置于SP-2000 UV型紫外可见分光光度计中，于最大吸收波长490 nm处测定吸收度,以吸光度（Y）为纵坐标，对葡萄糖含量（X）为横坐标，绘制葡萄糖含量的标准工作曲线，见图1。

经回归分析，得到回归方程Y=0.06741+0.01243X，葡萄糖浓度在0.00506 mg/mL～0.04554 mg/mL范围内呈线性关系，R2=0.99966。

2.2 怀地黄和怀山药混合提取多糖的工艺路线

2.2.1 浸提液与乙醇对多糖的提取

称取怀地黄和怀山药（1∶1）40.2953g，粉碎至100目，加入30倍水，浸提4 h，3000 r/min离心30 min,离心收集得到第1次浸提液。向药渣中加入20倍水，90℃下浸提2 h后离心收集得到第2次浸提液，合并2次收集的浸提液，各取200 mL Sevag法加入40 mL的Sevag试剂（氯仿与正丁醇体积比为5∶1的混合液），剧烈振荡30 min，离心，回收上层清液，重复上述步骤，进行第2次蛋白的去除，离心后取上层清液减压浓缩至原液体积1/4，采用不同的浓缩倍数和沉降剂（乙醇）添加量进行沉降，3500 r/min离心，收集沉淀物，分析多糖得率。

2.2.2 正交试验的设计

怀地黄和怀山药混合提取多糖工艺条件的设计见表1，分别在不同条件下进行怀地黄和怀山药混合提取多糖，并测定相应条件下多糖含量。

表1 怀地黄和怀山药混合提取多糖正交试验因素水平表Table 1 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment factor level table

2.3 多糖得率的测定方法

利用苯酚-硫酸法对供试液怀地黄与怀山药混合多糖含量进行测定，取2 mL多糖供试液，分别加入6%苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5 mL，迅速振荡均匀,室温显色40 min，测定各供试液吸收值，利用回归方程求得供试液中葡萄糖的得率。多糖得率按下式计算：

式中：X为在Y吸光度下根据回归方程计算所得的值，ρ[6]为校正系数取 0.9。

3 结果与讨论

3.1 浸提液浓缩倍数与乙醇添加量对多糖提取的影响

乙醇是常用的多糖沉降剂。浸提液浓缩倍数（浓缩比）和乙醇添加量是影响多糖沉降的关键因素，对RGP的得率有较大的影响，结果见表2。

表2 浓缩比及乙醇加量对多糖得率的影响Table 2 Concentration ratio of ethanol addition on the effect of polysaccharide

由表2可知，浸提液浓缩比为4∶1时，多糖得率达到最高，为46.84%，这说明浓缩后浸提液过稀和过稠都不利于多糖沉降。此外，多糖得率达到最高时乙醇添加量为浓缩液的6倍量，说明尽管沉降剂乙醇可降低多糖溶解度促进沉降，但过低或过高的乙醇添加量又会减少或增加溶液总体积而对沉降产生不利影响。

3.2 怀地黄和怀山药混合提取多糖工艺条件的选择与确定

采用正交试验法优选混合怀地黄和怀山药（1∶1）提取多糖工艺，在多糖提取中，为了获得最大多糖含量，并结合生产实际，选择提取温度、提取液pH和固液比3个主要工艺参数作为考察因素，每因素选取3个水平，按L9（33）正交表安排试验，以多糖含量作为衡量提取效率的指标，优选最佳工艺参数。为了提高其统计分析的可靠性，每一条件下进行3次重复试验（n=3），测定结果取其平均值供统计分析用，见表3。

表3 混合怀地黄和怀山药提取多糖正交试验L9（33）方案及试验结果Table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme andresults

续表3混合怀地黄和怀山药提取多糖正交实验L9（33）方案及实验结果Continue table 3 Rehmannia glutinosa and Dioscorea opposita polysaccharide extraction orthogonal experiment L9(33)scheme and results

由表3可见，因素A（提取温度）对混合物多糖的提取有显著影响，而因素C（pH）、B（料液比）对提取无显著影响。由极差R得出影响因素大小顺序为：A>B>C。最佳提取工艺参数为A2B1C2。依据上述最佳工艺A2B1C2验证（n=3），怀地黄和怀山药混合提取多糖平均含量为44.78%。

4 结论

怀地黄和怀山药混合提取多糖的最佳工艺参数为：浸提温度 65 ℃、浸提液 pH 5.0、固液比为 1∶20（g/mL）、浸提液浓缩比为4∶1，沉降剂乙醇添加量6倍于浸提液体积；混合提取多糖率为44.78%。可为深入开展怀地黄多糖和怀山药多糖的综合利用提供理论参考。

[1]李红霞,许闵,孟江,等.怀地黄多糖的含量测定[J].河南科学,2002,20(2):144-146

[2]李静静,缪娟,张磊,等.怀山药多糖分析方法及生物活性的研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(35):20008-20009,20039

[3]王洪新,王远辉.山药多糖研究进展[J].食品与生物技术学报,2011,30(3):321-325

[4]原增艳,刘红记,刘新育,等.响应面分析法优化怀地黄多糖的微波提取工艺[J].中国农学通报,2010,26(9):60-64

[5]陈曦,骆健美,王敏.怀地黄和怀山药多糖同步提取工艺研究[J].时珍国医国药,2009,20(5):1228-1230

[6]张惟杰.复合多糖生化研究技术[M].上海:上海科学技术出版社,1987:6-7

The Optimization Process of Extracting Polysaccharide from the Mixture of Rehmannia and Huai Yam

LI Chao-zhu,CHEN Yan-hui*,YAN Mu-ying,HUANG Xue-ren,HUANG Gui-qiu
（Qinzhou University,Qinzhou 535000,Guangxi,China）

2012-03-13

李超柱（1957—），男（汉），副教授，学士，研究方向：天然产物化学和有机合成。

*通信作者：陈艳辉（1958—），女（汉），教授，学士，研究方向：天然产物化学和有机合成。