响应面法和正交试验对骨素酶解工艺优化的比较

张崟，王卫，张佳敏，蒲登顺

（成都大学四川省肉类加工重点实验室，四川成都610106）

响应面法和正交试验对骨素酶解工艺优化的比较

张崟，王卫，张佳敏，蒲登顺

（成都大学四川省肉类加工重点实验室，四川成都610106）

探讨酶解骨素的最优工艺及对优化实验方法的选择提供借鉴，通过响应面法和正交试验分析了酶解骨素的最优工艺，并对结果进行比较，发现两种试验设计方法在分析各因素对水解度的影响上得出的结果相同，即酶浓度>时间>温度>pH，但是响应面法对数据的统计分析优于正交试验；两种方法获得的最优工艺验证实验显示，响应面法得出的最优工艺所得的水解度比正交试验高出15.4%。酶解骨素的最优工艺确定以响应面法为准，为酶解温度60℃、酶解时间 5 h、pH 4、酶用量 0.146 mkat/g。

正交试验；响应面；骨素；酶解

Abstract:The optimal hydrolysis processing for bone extract was investigated by two methods(orthogonal design experiment and response surface design experiment);and the obtained optimal hydrolysis processing from the two methods were compared.The results indicated that the two methods obtained the same results when they were used to analyze the effect of single factors on hydrolysis rate,namely,concentration of enzyme>time>temperature>pH,but the response surface method showed a better analysis than that of the orthogonal method.Verification testing results indicated that the hydrolysis rate,from the optimal processing of response surface method,was 15.4%higher than that of orthogonal method.The optimal processing was decided according to response surface method,and the optimal processing was temperature 60℃,time 5 h,pH 4,the addition amount of papaya protease 0.146 mkat/g.

Key words：orthogonal design experiment;response surface;bone extract;hydrolysis

酶解技术以其温和的反应条件和高效的催化作用而在畜禽骨利用中广泛应用。由于酶解时涉及的影响因素比较多，所以采取适当的实验方法对各因素进行优化以获得最佳酶解工艺非常必要。在进行优化实验时，正交试验或响应面法是常用的实验设计方法，如在酶解利用鸡骨[1]、鸡骨泥[2]、骨胶原蛋白中用响应面法获得最佳的酶解条件[3]；在酶解利用新鲜猪骨[4]、鸡骨[5]、羊骨中用正交实验获得最优的酶解工艺条件[6]等。

响应面法是由Box和Wilson在1950年最早提出来的用于获得最优实验条件的方法，在化学和化学工程领域都有成功的应用[7-8]。正交试验又称正交拉丁方试验，是以拉丁方的正交性为依据，从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，以获得最优的因素组合和最佳实验结果，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法[9]。如今，这两种实验设计方法已在食品工业有广泛的应用。

目前，国内外对这两种优化实验设计方法的优化效果优劣的对比较少，这容易导致选择优化实验方法时的盲目性。因此，为了探讨酶解骨素的最优工艺和对优化实验方法的选择提供借鉴，本文将这两种优化实验方法同时应用于骨素酶解条件的优化，以探讨这两种优化实验设计方法应用效果的差别。

1 材料和方法

1.1 材料

木瓜蛋白酶购于北京奥博星生物技术有限责任公司，酶活力8.35 mkat/g；柠檬酸与磷酸氢二钠、甲醛均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 骨素提取

将清洗干净的猪骨头，经PG-150破碎机（廊坊冠通机械有限公司）破碎成块，然后加入到提取罐进行高温高压（0.1 MPa，121℃）煮4 h，将提取液过滤、静置后采用SO-97油水分离机（上海征富机械有限公司）分离得到骨素。

1.2.2 酶解条件

固定料液比为1∶10（g/mL）。调节pH后加入一定量木瓜蛋白酶，置于DZKW-4水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）酶解不同时间。酶解后取上清液5 mL，用TGL-16G离心机在4000 r/min下离心5 min，所得上清液用于检测分析。

1.2.3 水解度计算

水解度是指酶解液中游离氨基态氮的含量占总氮量的百分比。游离氨基态氮采用甲醛电位滴定法测定[10]。水解度计算式如下：

水解度/%=酶解液氨基氮/酶解体系总氮×100

1.2.4 响应面设计

采用4因素、7中心、4响应、31次实验的中心旋转设计，对木瓜蛋白酶酶解工艺条件进行分析和优化。酶解条件的限值选择根据文献[11]。因素编码及因素水平见表1。

表1 因素编码及因素水平Table 1 Coded levels of experiment factor for response surfacedesign

1.2.5 正交试验设计

以温度 40℃～60℃、加酶量 0.084 mkat/g～0.167 mkat/g、时间 2 h～5 h、pH 4～6 为各因素的变化范围[11]，选择L9（34）正交表设计正交试验。正交试验因素及水平见表2。

表2 正交试验因素及水平Table 2 Levels of experiment factor for orthogonal design

1.2.6 数据分析

采用SAS9.0进行响应面设计及数据分析，其余数据利用Excel 2003进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化酶解骨素工艺

2.1.1 酶解条件拟合

响应面实验方案及试验结果见表3。

表3 响应面实验方案及试验结果Table 3 Response surface program and experiment results

以水解度为因变量，酶解温度、酶解时间、pH及加酶量为自变量，对实验结果进行拟合，所得主拟合模型的显著性分析见表4，单因素对水解度的影响分析见表5。

表4 数学模型的显著性分析Table 4 Significant analysis of relativity model

表5 单因素对水解度的影响分析Table 5 Significant analysis of signal factors

表4中p值显示，水解度与酶解温度、酶解时间、pH及加酶量之间存在显著（P=0.026<0.05）相关性；拟合模型中一次项对水解度有显著影响（P<0.05）；拟合模型中二次项对水解度的影响不显著（P＞0.05）。

表5中p值显示，温度、时间和加酶量的p值均小于0.05，说明温度、时间和加酶量对水解度的影响显著；而pH的p值大于0.05，说明pH对水解度的影响不显著。比较各因素的p值，可知p加酶量>p酶解时间>p酶解温度>ppH，因此，各单因素对水解度的影响程度大小依次为酶浓度>时间>温度>pH，即酶浓度对水解度的影响最大，其次为酶解时间和温度，pH对水解度无显著影响。

2.1.2 酶解工艺条件优化

在建立酶解条件与水解度的数学模型基础上，对实验结果进行优化。以水解度为最大值，酶解温度、酶解时间、pH及加酶量的极值为评判参考，分析最优工艺，优化结果的响应面见图1。

由图1可知，得出温度60℃、时间5h、pH4、酶用量0.146mkat/g时骨素的水解度最高。由此可知，酶解温度60℃、酶解时间5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g时，酶解效果最好。

2.2 正交试验优化酶解骨素工艺

根据单因素试验确定的酶解温度、酶解时间、pH值及酶浓度[11]，利用L9（34）正交表建立的正交试验方案及实验结果见表6。

表6 L9（34）正交试验方案及结果分析Table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

续表6 L9（34）正交试验方案及结果分析Continue table 6 L9(34)Orthogonal design and experiment results analysis

对表6中的水解度进行统计分析，所得K值及R值见表6，K值及R值分布见图2，图3。

由表6中的K值及图2可知，温度60℃、时间5h、pH 4、酶浓度0.167 mkat/g时水解度最高。因此，酶解骨素的最优工艺为温度60℃、时间5 h、pH 4、酶浓度0.167 mkat/g。

由表6中R值及图3中R值分布可知，各因素对水解度的影响程度由大到小依次为酶浓度>时间>温度>pH，即酶浓度对水解度的影响最大，其次为酶解时间和温度，pH对水解度的影响最小。

2.3 响应面分析与正交试验验证比较

2.3.1 影响因素分析

比较正交试验及响应面法所得的各因素对水解度的影响程度分析，得出两者的分析结果是相同的，即酶浓度>时间>温度>pH，但是正交试验对数据的分析不仅信息量少，而且未能体现各因素对水解度是否有显著性影响，而响应面法对数据的分析比较详细，不仅可以知道各因素对水解度的影响大小，而且可以知道各因素是否对水解度有显著性影响。因此，响应面法与正交试验相比，在对各因素对水解度影响程度及显著性的分析上优于正交试验。

2.3.2 优化工艺验证

通过正交试验和响应面得到的最优工艺见表7。分别以表7中的酶解条件为反应条件，做验证试验，所得水解度见表7。

表7 最优工艺数据对比验证Table 7 Comparison of verification test results

表7中水解度显示，用响应面法和正交试验求出的优化参数获得的水解度分别为1.613%和1.398%，可见用响应面优化参数获得的水解度明显高于正交试验，而且比正交试验高出15.4%。

3 结论

通过比较响应面法和正交试验对酶解骨素条件的优化结果，发现两种试验设计方法在分析各因素对水解度的影响上得出的结果相同，即酶浓度>时间>温度>pH，但是响应面法对数据的统计分析优于正交试验；两种方法获得的最优工艺的验证实验数据显示，响应面法得出的最优工艺获得的水解度比正交试验高出15.4%。总之，在酶解骨素工艺的优化上，响应面法优于正交试验。酶解骨素最优工艺的确定以响应面法为准，最终确定为酶解温度60℃、酶解时间5 h、pH 4、酶用量0.146 mkat/g。

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Comparison of the Optimized Hydrolysis Processing for Bone Extract Obtain by Orthogonal and Response Surface Design Experiments

ZHANG Yin,WANG Wei,ZHANG Jia-min,PU Deng-shun
（Sichuan Province Key Laboratory of Meat Processing，Chengdu University,Chengdu 610106,Sichuan,China）

2011-11-11

张崟（1981—），男（汉），副教授，研究生，研究方向：农产品加工与保藏。