荔枝果肉多酚的提取与分离

冯卫华，于立梅，秦艳，李冰霞，白卫东

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

荔枝果肉多酚的提取与分离

冯卫华，于立梅，秦艳，李冰霞，白卫东

（仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225）

以荔枝果肉为试验材料，以多酚含量为评定参数，提取分离其中的多酚物质。以乙醇溶液为提取溶剂，通过单因素试验和正交试验，考察了浓度、提取时间、料液比、提取温度、浸提次数等影响提取率的几个重要因素，得出影响果肉中多酚提取的因素由大到小依次为，提取时间>料液比>乙醇浓度>提取温度，最佳工艺条件为，乙醇浓度70%，料液比1∶11，浸提时间6 h，浸提温度40℃，浸提2次，而且荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚体为主，其次是低聚体和单体。

荔枝；多酚；提取；优化；分离

Abstract:The optimum extraction conditions of phenolics from Litchi pulp were attained at a solvent-to-solid ratio of 11∶1 by agitated maceration with 70%ethanol at room temperature in the dark for 6 h from freezen sample.The residue was extracted repeatedly.The combined extracts were defatted by hexane,and then extracted by diethyl ether-ethyl acetate(1/1)to obtained Litchi phenolic extracts.And Litchi pulp polyphenols were mainly water-soluble polyphenol content,secondly oligomer and monomers content.

Key words：litchi;phenolic compounds;extraction;optimization;separation

荔枝（Litchi Chinensis Sonn.）营养价值高，风味独特，被誉为“岭南佳果”[1-2]。并且，荔枝中还含有荔枝多酚等多种活性成分，对降血压、降血脂、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、增强免疫力均有一定功效[3-7]。

荔枝采后极易褐变腐烂，荔枝深加工生产迫在眉睫。由于，新鲜荔枝酿酒提高了荔枝的商品价值，是荔枝产业持续发展的重要方向[8]。然而荔枝酒产品在装瓶后或货架期时存在氧化褐变、风味劣变等问题，这不仅影响了产品的外观和风味，而且荔枝酒的营养成分也随之发生变化，经济价值下降。

据报道，荔枝与荔枝壳褐变其主要原因是多酚物质氧化褐变的结果[9-10]。荔枝多酚在荔枝果皮叶、果肉、果核种皮中都有分布，荔枝叶及果皮多酚提取已有系统研究[11-12]，如何有效提取荔枝果肉中的多酚，进一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的变化，为控制荔枝酒加工过程中褐变，进一步改进荔枝酒加工工艺，防止营养物质损失提供理论参考。

由于提取条件决定了提取物质的提取质量和提取率，因而提取工艺很重要[13-14]。传统的溶剂提取法因成本低、对活性物质选择性强、易控制等优点在工业中普遍流行[13，15]。本研究选用溶剂提取法提取荔枝果肉中的多酚，以总酚含量作为评价指标，优化荔枝果肉多酚的提取条件。

为了有效分离荔枝多酚，对经优化浸提的荔枝果肉提取液选用正己烷、乙酸乙酯∶无水乙醚（1∶1）分步萃取分离。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料预处理

荔枝：广州市从化顺昌源绿色食品有限公司。

新鲜的荔枝用不锈钢刀迅速去除果皮、果核，将果肉装入塑料袋中，立即冷冻（-18℃），保存备用。

1.1.2 试验试剂

没食子酸、福林试剂：Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 试验设备

W-754紫外可见分光光度计：北京瑞利分析有限公司；R205旋转蒸发仪：无锡市星海王生化设备有限公司。

1.2 总酚（TPC）的测定

总酚（TPC）的测定采用福林-肖卡法[16]。

1.2.1 标准曲线绘制

准确称取0.5 g没食子酸溶于蒸馏水中，然后定容至100 mL，再取此原液0.5 mL稀释至50 mL，即为标准溶液。准确量取 0.05、0.1、0.15、0.25、0.5 mL 于 10 mL容量瓶中，各加3 mL蒸馏水，摇匀，再加0.25 mL福林试剂，充分混匀。1 min后，加入20%Na2CO3溶液0.75 mL混匀，用蒸馏水定容。混合液于75℃恒温下水浴10 min后，立即冰浴，于760 nm波长下1 cm比色杯比色，由测得的吸光度绘制标准曲线。空白用蒸馏水代替没食子酸标准溶液。

1.2.2 测定

取0.25 mL适当浓度的样品液（用提取溶剂稀释）于10 mL容量瓶中，空白用提取溶剂代替样品，其余操作同上。根据测得的吸光度从标准曲线计算得荔枝多酚的含量。荔枝总酚的含量表示为每克新鲜样品中含有的总酚量（以没食子酸计，μg GAE/g FW）。

1.3 单因素试验

1.3.1 浸提溶剂浓度的确定

用冷冻荔枝果肉为材料，选用浓度分别为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液作为浸提溶剂，料液比为1∶7，在60℃水浴锅避光浸提6 h，过滤得到滤液，立即测定其总酚含量。

1.3.2 料液比的确定

用冷冻荔枝果肉为材料，采用80%的乙醇溶液作为提取溶剂，料液比为 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13，在 60 ℃水浴锅避光浸提6 h，过滤得到滤液，立即测定其总酚含量。

1.3.3 浸提时间的确定

用冷冻荔枝果肉为材料，采用80%乙醇溶液作为浸提溶剂，料液比为1∶9，在60℃水浴锅避光浸提2、4、6、8、10 h，过滤得到滤液，立即测定其总酚含量。

1.3.4 浸提温度的确定

用冷冻荔枝果肉为材料，采用80%的乙醇溶液作为提取溶剂，料液比为 1∶9，在 25、40、50、60、70 ℃水浴锅分别避光浸提6 h，过滤得到滤液，立即测定其总酚含量。

1.3.5 浸提条件优化

在上面单因素试验的基础上，以乙醇为浸提剂，考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度四因素对荔枝果肉多酚提取效果的影响，拟定四因素三水平，采用L9（34）表进行正交试验，分析荔枝果肉多酚在不同浸提条件下的提取率，确定最佳提取条件。

1.3.6 浸提级数的确定

以冷冻荔枝果肉为材料，采用优化的浸提条件连续重复提取3次，立即测定每次浸提液中的总酚含量。

1.3.7 荔枝多酚的分离

将荔枝果肉（5.0 g左右）用优化的浸提条件连续重复提取2次，过滤，合并两次浸提液。将浸提液旋转蒸发除去乙醇（40℃）至体积约为50 mL左右，将浓缩液经等体积正己烷萃取去脂8次，再用等体积乙酸乙酯∶无水乙醚（1∶1）萃取荔枝多酚6次，将合并的乙酸乙酯/无水乙醚相旋转蒸发（30℃）至干燥。将合并的水相放在干燥箱中40℃～50℃干燥，将正己烷相、乙酸乙酯/无水乙醚相、水相等干燥物分别定容，测定其多酚的含量。

1.3.8 数据统计与分析

每个提取试验均重复3次，每个测定均重复3次。结果表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 11.5软件（SPSS Inc,Chicago,IL,USA）对所有数据进行方差分析，利用邓肯式多重比较对差异显著性进行分析，p<0.05表示显著，p<0.01表示极显著。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对荔枝果肉多酚提取的影响

图1为乙醇浓度分别为60%、70%、80%、90%、100%时，荔枝果肉提取液中总酚含量的变化。结果表明，采用80%乙醇浓度浸提，提取液中总酚含量最高，多酚含量显著高于其他浸提液提取的总酚含量（p<0.05）。因此初步确定乙醇浓度为80%比较合适。

2.2 料液比对荔枝果肉多酚提取的影响

图 2 为料液比分别为 1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13 时，荔枝果肉提取液中总酚含量的变化。结果分析表明，料液比对荔枝果肉提取液中总酚含量的影响显著（p<0.05）。采用1∶13浸提，提取液中总酚含量最高，并且随着料液比的增大，荔枝果肉多酚浸提量显著增加p<0.05）。根据Rubilar等[17]的研究，浓度梯度是提取的动力，因而提高料液比对提取有正面影响。然而，提高料液比虽然有利于总酚的提取，但当料液比达到某一极限时，再提高料液比收效不大（后一级料液比较前一级料液比增加的提取率分别为46.9%、36.7%、28.0%、18.1%）。由结果分析并考虑到浓缩时间，可将料液比确定为 1∶9。

2.3 提取时间对荔枝果肉多酚提取的影响

图 3 为浸提时间分别为 2、4、6、8、10 h 时，荔枝果肉提取液中总酚含量的变化。

结果分析表明，浸提时间对荔枝果肉提取液中总酚含量的影响显著（p<0.05）。采用6 h浸提，提取液中总酚含量最高。显然，多酚的充分提取需要足够的浸提时间，但是由于提取过程中多酚长时间处于高温下，造成部分氧化，因而延长提取时间提取率反而下降[18]，因此，浸提时间不能太长。因此初步确定浸提时间6 h。

2.4 提取温度对荔枝果肉多酚提取的影响

图 4为提取温度分别为 25、40、50、60、70℃时，荔枝果肉提取液中总酚含量的变化。结果表明，采用40℃浸提，提取液中总酚含量最高，其总酚含量显著高于提取温度分别为 25、50、60、70℃的总酚含量（p<0.05）。显然，适宜的温度有利于多酚的提取。综合考虑，本试验选择温度为40℃。

2.5 各因素综合变化对荔枝果肉多酚提取的影响

以上结果均为单因素变化对荔枝果肉多酚提取的影响。为了全面考察乙醇浓度、料液比、浸提时间、浸提温度4个因素对荔枝果肉多酚提取效果的影响，设计了四因素三水平正交试验。因素水平的选择是由单因素结果并综合考虑时间效应而定。因素水平见表1，正交表及正交结果见表2，根据表2正交试验结果，得表3方差分析结果。

通过表2正交试验分析结果表明，影响荔枝果肉多酚类物质浸提量的因素主次顺序为：B>C>A>D，即浸提时间对荔枝果肉提取液中总酚含量的影响最大，其次为料液比，乙醇浓度又次之，浸提温度影响最小。荔枝果肉多酚的最佳提取条件为A1B2C3D1，即：70%乙醇按1∶11的料液比在温度40℃下浸提6 h，荔枝果肉多酚浸提效果最好。表3方差分析结果表明，浸提时间对荔枝果肉多酚提取的影响达到极显著水平（p<0.01）；乙醇浓度和料液比二因素对荔枝果肉多酚提取的影响达到显著水平（p<0.05）。又通过对每个因素的三水平进行多重比较，结果如下：A因素（乙醇浓度）3个水平最优是A1；B因素（提取时间）3个水平最优是B2；C因素（料液比）3个水平最优是C3，D因素（料液比）3个水平最优是D1。即通过方差分析结果确定最佳组合依旧为A1B2C3D1。

表1 荔枝果肉多酚浸提条件的因素水平表Table 1 Factors and levels for the optimization of phenolics extraction conditions from Litchi-pulp

表2 荔枝果肉浸提L9（34）正交试验方案及测定结果Table 2 Results of phenolics extraction from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal design

表3 荔枝果肉浸提L9（34）正交试验方差分析表Table 3 Variance analysis of phenolics extraction results from Litchi-pulp by L9(34)orthogonal experiment

2.6 浸提级数对荔枝果肉多酚提取的影响

荔枝果肉用优化的浸提条件连续重复提取3次，测定每次浸提液的总酚含量，见图5。结果分析表明，提取级数对荔枝果肉提取液中总酚含量的影响显著（P<0.05）。然而，第一、二、三次浸提总酚的量占总的总酚浸提量[（1.655±0.009）μg GAE/g FW]的比例分别为60.54%、21.67%、17.79%，第一、二次浸提的总酚量占总浸提量的83.21%。考虑到提取的成本和后续操作的繁琐与得率的关系，因此，本研究确定浸提次数为2次。

2.7 荔枝多酚的分离

采用优化提取条件浸提的荔枝多酚浸提液用正己烷、乙酸乙酯/无水乙醚（1:1）分步萃取，得到荔枝多酚浸提液的正己烷相、乙酸乙酯/无水乙醚相和水相，分别测定此三相中总酚的含量（图6）。结果分析表明，三相中多酚含量差异显著（p<0.05），其中，水相的总酚含量最高，乙酸乙脂/无水乙醚相的总酚含量次之，正己烷相最小，根据Calliste等[19]的研究，水相中含有的酚类物质多为多酚的多聚体，而正己烷相及乙酸乙酯/无水乙醚相则为多酚的低聚体和单体。因此，荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚体为主，其次是低聚体和单体。

3 结论

本研究选用溶剂提取法提取荔枝果肉中的多酚，以总酚含量作为评价指标，优化了荔枝果肉多酚的提取条件。影响荔枝果肉多酚提取的主要因素是浸提时间，其次为料液比，乙醇浓度又次之，浸提温度影响最小，荔枝果肉多酚浸提的最佳工艺条件即为：采用70%乙醇，按1∶11的料液比在温度40℃下浸提6 h，在此条件下浸提2次。荔枝果肉多酚主要以多酚的多聚体为主，其次是低聚体和单体。

本研究为进一步研究了荔枝多酚的成分与组成、荔枝多酚的生物活性，进一步研究荔枝果肉多酚的特性及其在荔枝酒加工中的变化，为控制荔枝酒加工过程中褐变，进一步改进荔枝酒加工工艺，防止营养物质损失提供理论性指导。

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The Optimum Extraction of Phenolic Compounds in Litchi Pulp

FENG Wei-hua,YU Li-mei,QIN Yan,LI Bing-xia,BAI Wei-dong
（College of Light Industry and Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,Guangdong,China）

2011-11-24

国家科技部星火计划项目（2007EA781003）；广东省科技计划项目（2007B023001002）；广州市科技计划项目（2007ZE0091）；广州市科技计划项目（2009C6-I051）；仲恺农业工程学院博士启动基金项目（G2360280）

冯卫华（1968—），女（汉），副教授，博士，研究方向：果蔬贮藏与加工、生物活性成分提取纯化及功能分析。