鲜麻山药酚类物质酶促褐变的研究

万瑾瑾，孙萍，刘旭海

（1.南昌市第三医院，江西南昌330006；2.江中药业股份有限公司，江西南昌330096）

鲜麻山药酚类物质酶促褐变的研究

万瑾瑾1，孙萍2，刘旭海2

（1.南昌市第三医院，江西南昌330006；2.江中药业股份有限公司，江西南昌330096）

对鲜麻山药酚类物质的分布，酚类物质的种类进行研究，从而确定一种酶促褐变的底物，对PPO酶的活性及其与褐变底物的亲和力进行分析和研究。表明鲜麻山药是由于酚类物质在PPO下进行的酶促褐变。并筛选出抑制麻山药PPO酶活力的最佳温度、酸碱环境和抑制剂。

鲜麻山药；酚类；PPO活力

Abstract:The relationship between the distribution of phenol and the type of phenol in fresh-cut yams was analyzed.Then the main browning substrate which led to enzymatic browning in fresh-cut yams was identified by thin-layer chromatography and absorption spectrum.The polyphenol oxidase enzame(PPO)activity and affinity with the main browning substrate was assayed.This result indicated that the browning in fresh-cut yams was mainly due to the oxidation of phenols.Screening the optimal temperature,optimal pH and optimal inhibitors that can inhibited the PPO activity.

Key words：fresh linen yam;phenol;PPO activity

山药的种类繁多，目前文献中报道的多是河南铁棍山药，但近年来铁棍山药的产量低，应用少，大多数山药饮片被“中国山药之乡”的“蠡县麻山药”取代。“蠡县麻山药”独有的药用价值正逐渐被大众所接受，是具有地理标志、独具规模的保护产品。其营养价值非常高，含有丰富的黏液质、淀粉、淀粉酶、氨基酸等成分，同时还含有一些维生素以及微量元素。

山药的饮片制备需要去皮干燥，但山药去皮后易发生褐变，影响药材质量。传统的山药护色加工工艺为硫磺熏制，残留的二氧化硫和亚硫酸盐对人类的健康存在潜在危害，因此研究新的护色方法，显得尤为迫切。首先必需对鲜麻山药的褐变机理展开研究，便于找寻较优的抑制褐变方法。

山药[1-3]和其他薯蓣[4]的主要氧化酶集中在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）上，能促进酚类物质的氧化，引起褐变。对山药中酚类物质种类的研究报道少，因此针对麻山药中的酚类物质及引起酶促褐变的PPO酶活力展开研究。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料与试剂

鲜麻山药：产自河北安国蠡县大曲堤乡种植地；染色液：0.5%FeCl3和 0.5%K3[Fe（CN）6]的 1∶1 混合液；钢刀；NaOH；HCl；吐温-60；甲萘酚；愈创木酚；邻苯二酚；磷酸；磷酸氢二钠；无水硫代硫酸钠；植酸；EDTA-2Na；柠檬酸；氯化钙；氯化钠；抗坏血酸钠；所有试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器

超声波清洗仪SK5200H：200 W，59 kHz上海科导超声仪器有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计；TL-5.0W台式离心机：上海离心机械研究所；METTLER AE240电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司；奥林巴斯数码相机。

1.2 试验方法

1.2.1 鲜切麻山药的染色与自然褐变

参照王佳宏等[5]的方法略有改进。取鲜麻山药，洗净，一部分钢刀去皮，横切成片，未去皮部分直接横切成片。分别将所准备鲜麻山药泡于染色液中，取出后，对比被染成蓝色的区域与鲜切麻山药片未染色的常规褐变区域。

1.2.2 酚类物质供试品溶液的制备

取鲜麻山药20 g，去皮，加95%乙醇少许，冰浴碾磨成匀浆后离心（4000 r/min，4℃，15 min），上清液减压浓缩至干，残渣用15 mL乙酸乙酯抽提3次，合并抽提液，保存于冰箱中，即为供试品溶液。

1.2.3 酚类物质对照品溶液的制备

分别配置甲萘酚、愈创木酚和邻苯二酚的0.6mL/min对照品溶液。

1.2.4 薄层层析的方法

吸取供试品溶液以及甲萘酚、愈创木酚、邻苯二酚的标准品溶液各约10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇=5∶1为展开剂，展开，取出，晾干，用染色液显色。

1.2.5 PPO酶液的提取方法

参照周玉婵[6]和仲飞[7]的方法，略有改进。取待测麻山药块茎，清洗去皮，取10 g样品，加少许预先冷藏的磷酸缓冲液（PBS：pH6.0），冰浴研磨，然后加 10 mL缓冲液冷冻离心（4000 r/min，15 min，4℃），上清液即为PPO酶液。制成的酶液置于低温（4℃）下备用。

1.2.6 PPO活力的测定[7]方法

采用消光值法。吸取磷酸缓冲液（pH6.0）1.5 mL，加入1mL0.02mol/L的儿茶酚溶液，先于30℃保温5min，再加1 mL的酶液，迅速混匀后立即在410 nm处进行紫外测定并纪录A410的变化（每隔30秒记录1次吸光值），共记录5 min，重复测3次。一个活力单位（U）定义为测定条件下每0.5分钟引起吸光值改变0.01的酶量，设为OD值。

1.2.7 褐变指数的测定方法

采用消光值法[8]。取处理后的麻山药粉2 g，置于洁净的碘量瓶中，加入纯水及甲醇的混合液（1∶1）20 mL，在50℃水浴锅中加热30min，离心（4000r/min，15min），取上清液，在波长410 nm处测定吸收值，作为褐变指数。

1.2.8 相关计算公式

以每分钟吸光值变化0.01为一个活力单位（U），设为OD值，计算所有样品的酶活力单位数。OD=△A/（0.01×t）×D（D 为稀释倍数）。

1.2.9 温度对PPO活力的影响

将酶液反应体系分别置于 15、30、45、60、75 ℃的缓冲液（pH 6.0）中测定PPO活力，得到麻山药PPO酶的最佳反应温度。

1.2.10 pH对PPO活力的影响

将酶液反应体系用磷酸缓冲液调至不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10），测定 PPO 活力，得到麻山药 PPO 酶的最佳钝化pH。

1.2.11 底物浓度对PPO活性的影响

分别以 0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L的邻苯二酚作底物，测定不同底物浓度下麻山药PPO的活性大小（pH 6.0、30℃）。根据Linewear-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/[s]}+1/Vmax求得此条件下的Km及Vmax值。

1.2.12 无硫护色抑制剂对PPO活力的影响

分别以浓度为0.15%抗坏血酸钠、0.25%柠檬酸、0.25%CaCl2、0.25%Na2SO3、0.02%EDTA-2Na、1%NaCl、0.1%植酸等多种化合物与等体积的酶液混合，室温下静止30 min，在pH 6.0条件下测定PPO活力，比较不同化合物对PPO的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 鲜麻山药褐变与酚类物质的关系

被染成蓝色的区域为酚类物质的分布区域，见图1，与鲜切麻山药片未染色的常规褐变图2对比。

图1显示，酚类物质多分布在周皮及维管束脉管切口部位，并与鲜麻山药常规放置发生褐变（图2）的部位非常一致。图2中，周皮部位褐变程度有差异，这与去皮的厚薄有关，说明切除的皮越厚，周皮部位残留的酚类物质越少，褐变程度越小。

2.2 鲜麻山药中酚类物质的薄层定性

试验结果显示，供试品在与对照品色谱的相应位置上，有两个相同颜色斑点，且有许多其他酚类的显色斑点，见图3。

麻山药酚类提取物与Rf值分别为0.697和0.462的愈创木酚和邻苯二酚相应位置上，有相同的显色反应，故麻山药酚类提取物中含有愈创木酚和邻苯二酚。且麻山药所含酚类物质种类还有很多，如果要抑制褐变的产生，从酚类物质着手较困难。

2.3 温度对PPO活力的影响

温度对PPO活力的影响见图4。

图4表明，麻山药PPO酶的最活跃温度在15℃~45℃之间，温度在30℃酶活力最大。当温度升至45℃以上时，PPO活力相对较低；60℃以上时活力低且相对稳定，综合资源的合理利用，可选择60℃作为麻山药最适宜减少褐变的温度。这与黄绍华等[3]、李晓莉等[9]、邱雁临等[1]所做的山药PPO特性研究中所得的结果相近。

2.4 pH对PPO活力的影响

pH对PPO活力的影响图5。

由图5可知，PPO酶在碱性环境及在酸性环境pH为3和6的PPO酶活力较大，是PPO酶的最适宜酸碱度。由于酚类物质显弱酸性，在碱性环境中不稳定，故推测在碱性缓冲液中的PPO酶活力测定有误差，将pH为3和6定为PPO酶的最适反应酸碱度。

经感官鉴定，pH为3条件下的山药片色白，但按1.2.7方法处理后的溶液较浑浊，故测得的褐变指数值较高，其他感官结论与褐变值一致。因此当pH=6时，是PPO酶最适反应酸碱度；pH=4和5时，为最佳抑制酶活力酸碱度。

2.5 底物浓度对PPO活力的影响

底物浓度对PPO活力的影响见图6。

由图6可知，当底物(邻苯二酚)浓度较低时，反应速度与底物近似呈线性关系；随着底物浓度增加，反应速度增加变缓；当底物浓度大于0.06 mol/L时，酶活性不再上升，而出现下降趋势。由此可见，当底物浓度趋于Km时，反应速度趋向最大值（Vmax），即麻山药PPO活性的最适反应底物浓度是0.06 mol/L。底物浓度与PPO活性的关系完全遵循Michaelis-Menten的酶动力学性质。

根据Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/[s]}+1/Vmax，以1/V为纵坐标，1/[s]为横坐标作图7，求得Km=61 mmol/L，Vmax=25.6 U/min，其中拟合直线为Y=2.3808X+39.045，相关系数r=0.9995，表明麻山药PPO对邻苯二酚有极强的亲和力。在一定的温度、pH和酶液浓度条件下，酶催化反应速度的初始阶段与邻苯二酚底物浓度成正比。

2.6 抑制剂对PPO活力的影响

0.15 %抗坏血酸钠、0.25%柠檬酸、0.25%CaCl2、0.25%Na2SO3、0.02%EDTA-2Na、1%NaCl、0.1%植酸对鲜切山药PPO活力的影响见表1。

不同化合物对PPO抑制程度的差异结果显示抗坏血酸钠和Na2SO3有很强的抑制作用，EDTA-2Na和CaCl2也有一定的抑制作用，柠檬酸、NaCl和植酸的抑制作用较弱。

表1 抑制剂对PPO活力的影响Table 1 PPO activity's influence by inhibitors

抗坏血酸钠的褐变抑制率虽然高，但它本身被氧化后会变红色，同样影响山药的外观和质量。Na2SO3是最佳PPO酶抑制剂。

3 结论

1）麻山药酚类物质多分布在周皮及维管束脉管切口部位，与褐变部位相一致，因此麻山药的褐变与其酚类物质有关。

2）鲜麻山药易褐变，影响山药药材质量，山药的褐变正是愈创木酚和邻苯二酚等酚类物质在多酚氧化酶的作用下氧化导致，酚类种类多且含量较高，抑制褐变的发生应从种类相对单一的PPO酶出发。研究结果显示，鲜麻山药PPO酶对底物邻苯二酚的Km=61 mmol/L，Vmax=25.6 U/min，抑制PPO酶活力的最佳条件是温度在60℃，pH在4和5之间，用含0.25%Na2SO3的PPO酶抑制剂处理。

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[3]黄绍华,胡晓波,王震宙.山药中多酚氧化酶的活性测定及其护色研究[J].食品与发酵工业,2005,31(6):27-29

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[5]王佳宏,郁志芳,杜传来.芋艿褐变底物及多酚氧化酶特性研究[J].食品工业科技,2008,29(2):141-145

[6]周玉婵,潘小平.采后低温诱导菠萝PPO活性升高的机理及其抑制途径[J].园艺学报,1997,24(3):236-238

[7]仲飞.红星苹果多酚氧化酶某些特性及其抑制的研究[J].园艺学报,1998,25(2):184-186

[8]王清章,刘怀超,孙颉.莲藕贮藏中褐变度及多酚氧化酶活性的初步研究[J].中果蔬菜,1997(3):4-6

[9]李晓莉,沈金玉,黄家音.山药多酚氧化酶特性研究[J].精细化工,2005,22(7):527-529

The Research of Phenols Browning in Fresh Yams by Enzymatic Browning

WAN Jin-jin1,SUN Ping2,LIU Xu-hai2
(1.The Third Hospital,Nanchang 330006,Jiangxi,China;2.Jiangzhong Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanchang 330096,Jiangxi,China)

2011-11-27

万瑾瑾（1987—），女（汉），硕士研究生，研究方向：新制剂与新工艺。