超声诱导法提取土豆中多酚氧化酶的工艺研究

熊海涛

（陕西理工学院化学系，陕西汉中723001）

超声诱导法提取土豆中多酚氧化酶的工艺研究

熊海涛

（陕西理工学院化学系，陕西汉中723001）

应用超声诱导法对土豆中多酚氧化酶进行了粗提,并以邻苯二酚为底物考察了温度、时间和固液比对土豆多酚氧化酶活性的影响并进行了正交试验。结果表明：土豆多酚氧化酶酶促反应产物在408 nm下有最大吸收峰，提取最佳工艺条件为：超声温度40℃，超声时间270 s，超声固液比为60%，经超声波强化提取活力提高到原先的4.62倍。而正交试验优选出超声提取的最佳工艺：温度为35℃，时间240 s，液料比为70%。

土豆；多酚氧化酶；超声波；提取

Abstract:In this paper,potato polyphenol oxidase was extracted by ultrasonic decomposition method.and the effect of different temperature,time,mass fraction on its activity with Catechol as substrate was studied.The results showed that the product of enzymatic reactions has the soret peak at 408 nm and the optimum conditions were that supersonic wave extracting temperature at 40℃,treatment at 270 seconds,and the papaya of 60%mass fraction.In addition,treatment with ultrasonic wave could enhance the enzyme activity as much as 4.62 times.And the result of orthogonal experimental design indicated that optimal conditions were ultrasonic tempreture 35℃,extraction time 240 s and the ratio of buffering liquid to konjak 70%,respectively.

Key words：potato;polyphenol oxidase;ultrasonic wave;extraction

在人类和动植物活的机体中，普遍存在一类天然催化剂——酶类[1]。酶的制备一般包括3个基本步骤，即提取、纯化和结晶（或制剂），而酶的提取可采用多种方法，常用的细胞破碎法有高速组织捣碎[2]、玻璃匀浆器匀浆[3]、反复冻融法[4]、化学处理法、超声波处理法[5]等。多酚氧化酶（polyphenol oxidase,简称PPO）是一类广泛存在于植物体内的能催化多酚类氧化成醌类的含铜质金属酶，它是由核基因编码，在细胞之中合成通过一定方式转运至质体内而成为具酶活性的形式[6]。PPO具有较高的经济价值与食品工业，三废处理，医药卫生关系较密切，如利用PPO增强植物对病原菌的抗性改善红茶品质和啤酒风味，抑制果蔬、动物制品的褐变，以及利用PPO生物传感器和固定化酶制品检测环境中多酚类物质，处理工业三废﹑及农药降解产生的酚和芬胺等，故PPO具有较大开发价值[7]。20世纪90年代以后，植物多酚氧化酶的提取大多采用传统提取方法—缓冲溶液法（高速组织捣碎）[2-3，8-10]、丙酮法（反复冻融法）[2，4]，再经过各种分级沉淀﹑盐析﹑结晶﹑洗涤﹑层析等过程。冷丙酮法效果较差，酶活较低，可能跟丙酮引起酶蛋白不可逆变性有关，缓冲溶液法提取的酶的活性虽高于冷丙酮法。超声波提取是利用超声波具有的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、增大介质的穿透力以提取生物有效成分[11]，其提取的特点主要是:（1）不需加热，可以避免加热对有效成分的不良影响；（2）提取率高，节省原料；（3）节约溶剂；（4）有利于保持有效成分的生理活性；（5）提取物有效成分含量高，有利于进一步精制[12-13]，因此在天然产物有效成分的提取过程中也日益得到科研工作者们的充分重视[5]。

本文以新鲜土豆为原料，旨在通过超声诱导法提取土豆中多酚氧化酶,寻找其提取的最佳工艺条件,一方面为科学控制土豆加工过程中的酶促褐变提供参考，另一方面期望对PPO的应用有所帮助。

1 材料与方法

1.1 原料

土豆：从汉中当地市场购得，新鲜，无病虫害，个体完整无损害，表皮无霉。

1.2 仪器与试剂

邻苯二酚、磷酸氢二纳、磷酸二氢钠、柠檬酸均为分析纯，水均用二次蒸馏水。

HJ-I型磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；HH数显恒温水浴锅：上海手术器械厂；1800型高速离心机：河北黄骅市航天仪器厂；电子精密天平：GR-2000型日本；紫外分光光度计：中国普析；冰箱；超声清洗仪：日本本多。

1.3 试验方法

1.3.1 PPO粗酶液提取

新鲜土豆先用自来水、再用蒸馏水洗净，擦干，削去1 mm厚果皮取2 g样品放入5 mL（固液比为1∶2.5）磷酸缓冲液（pH为7）的研钵中，研磨1min。接着在HJ-I型磁力搅拌器中搅拌15 min，然后在600 W功率的超声波提取机上处理一段时间，接着1800-1型离心沉淀机中离心15 min，萃取上清液为PPO提取液。

1.3.2 酶反应产物吸收曲线扫描

酶液以1∶4稀释，反应体系为0.5mL酶液+0.04mol/L邻苯二酚+1.5 mL 0.01 mol/L磷酸盐冲液（pH为7.0）混匀反应1min后使用紫外分光光度计在300 nm~600 nm下进行吸收曲线扫描。

2 结果与讨论

2.1 酶促反应吸收曲线扫描

酶促反应产物在408 nm处有最大吸收峰，因此在后试验中采用408 nm为工作波长测定其吸光度。

2.2 单因素实验条件优化

2.2.1 超声处理时间对酶提取的影响

在室温25℃下，于pH为7.0的磷酸缓冲溶液中加浓度为0.05 mol/L的底物2.0 mL，酶提取液1.0 mL，固液比为30%，在600 W功率的超声波提取仪上分别进行 60、120、180、240、260、270、280，300，360 s，离心，得样品溶液后测定酶活力[14]，以酶活力对超声时间作图1。

由图1可以看出，超声开始的一段时间里，随着超声波处理时间的延长，形成的气泡越多，高频振荡越剧烈，吸收的声能越大，破壁的效果越好，因而酶的溶出增多，但并不是超声时间越长酶的浓度越高。处理时间过长提取物由于超声波的强烈震荡及热效应的作用而被破坏，特别是酶类。超声波处理时间过长会导致酶活力下降，并且植物组织中大量细胞破裂导致细胞内大量不溶物及较多的粘液质等混入提取液中，使溶液中杂质增多黏度增大，从而增大了传质阻力影响有效成分的溶出。结果表明：超声时间为270 s时提取效果最佳。

2.2.2 超声波处理温度对酶提取的影响

称取2 g土豆加入5 mL磷酸缓冲液（pH为7.0）研磨1 min后用600 W的超声波分别在不同温度下进行超声处理，离心，得到样品溶液后测定酶活力见图2。

由图2可知，随着温度的升高酶活力增大，达到40℃如继续升高温度含量呈下降趋势，原因可能是超声温度升高了多酚氧化酶在溶剂中的溶解度，同时提取液的粘度减小，扩散系数增加，促使提取速度加快，从而提高了提取物的含量，但温度再升高活性成分被破坏，杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，成本费用增大，而且还造成了部分溶剂的损失，因此超声提取温度40℃为宜。

2.2.3 超声处理固液比对酶提取的影响

称量一定量土豆与定量缓冲溶液（pH为7.0）进行研磨，配制成不同质量分数的果浆在室温在超声处理270 s，离心，得样品溶液后测定酶活力见图3。

由图3可见在固液比为20%~80%随着比例的增大细胞内外的渗透压加大，酶的溶出速度加快，酶的提取活性增加但当达到60%后再增大固液比酶活性降低，这是由于缓冲液加入量相对减少，实验操作过程可发现溶液较黏稠，则原料颗粒被破碎的机会越小，影响了超声波的效果，不利于酶的溶出，因此固液比以60%最适。

2.3 正交试验

在单因素试验的基础上，设计多因素共同作用的正交试验。本文以超声波处理时间、液料比、超声提取温度为主要考察因素，每个因素设立3个水平，采用L9（34）正交设计，以从土豆中提取的多酚氧化酶的存在酶活力为指标，优选超声波法提取魔芋中多酚氧化酶的工艺参数。正交试验因素与水平见表1，结果与分析见表2。

表1 正交试验因素与水平Table 1 factors of thogonal test and levels

表2 正交试验结果与分析Table 2 Result and analysis of thogonal test

表3 正交试验结果验证分析Table 3 Verification analysis of thogonal test result

由表1和表2可知，3个因素对提取效果的影响主次顺序为：超声时间＞超声温度＞液料比；最优水平的组合为A2B2C3。同时，对正交优化后所选择的工艺条件进行了验证（见表3所示），结果表明正交实验结果比较可靠。

3 结论

本文通过单因素试验，采用超声波法提取土豆中多酚氧化酶的最佳提取工艺条件：超声时间270 s，果浆质量分数为60%，温度为40℃，这时酶活力是未经超声波处理的4.62倍。而正交试验优选出超声提取的最佳工艺为温度为35℃，时间240 s，液料比为70%；极差分析表明：影响因素大小顺序为超声时间>温度>液料比。因此，提取土豆多酚氧化酶使用超声诱导法效率更高，而食品工作者可以通过调节pH和温度（采用瞬时高温的方法将其钝化）来控制土豆褐变的程度。

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Study on Extracting Technology of Polyphenol Oxidase from Potato by the Ultrasonic Decomposition Method

XIONG Hai-tao
（Department of Chemistry,Shaanxi University of Techonology,Hanzhong 723001,Shaanxi,China）

2011-12-29

陕西理工学院硕士专项基金（SLGQD0510）

熊海涛（1979—），男（汉），讲师，硕士，主要从事食品研究与相关分析。