金针菇黄酮类化合物清除DPPH自由基活性

2012-09-12方玉梅谭萍王毅红张春生

食品研究与开发 2012年7期

关键词：金针菇黄酮类提取液

方玉梅，谭萍，王毅红，张春生

（贵州六盘水师范学院，贵州水城553004）

金针菇黄酮类化合物清除DPPH自由基活性

方玉梅，谭萍，王毅红，张春生

（贵州六盘水师范学院，贵州水城553004）

以70%乙醇为溶剂提取金针菇黄酮类化合物，并以抗坏血酸（VC）和VE为对照品，采用DPPH法研究金针菇黄酮提取物对自由基的清除作用。结果表明：金针菇黄酮提取物具有抗氧化作用，在其浓度为44.775 μg/mL时其清除率可达17.24%，显著高于相同浓度下的VC和VE的清除率。认为金针菇黄酮提取物是一种有前途的天然抗氧化剂。

金针菇；黄酮；DPPH自由基

Abstract:The activity component was extracted with 70%ethanol.Using the assay system of DPPH,the antioxidant activities of the Flammulina velutipes Flavonoids were studied and compared with those of VEand assorbic acid.Results showed that the extracts of the Flammulina velutipes Flavonoids could inhibit lipid peroxidation and scavenge active oxygen free radicals.The elimination of the density of the Flammulina velutipes Flavonoids(44.775 μg/mL)was attained by 17.24%,and remarkable exceeded the same density VEand assorbic acid.The Flammulina velutipes flavonoids extracts showed strongest inhibitory effect on the antioxidation of superoxidized anionic and lipid peroxidantion.

Key words：the Flammulina velutipes；flavonoids；DPPH free radical

金针菇（Flammulina velutiper（Fr.）Sing.）学名毛柄金钱菌毛脚伞菌，因其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，属担子菌纲伞菌目白蘑科金钱菌属，且具有很高的药用食疗作用。金针菇在自然界广为分布，中国、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲、澳大利亚等地均有分布。在中国北起黑龙江，南至云南，东起江苏，西至新疆均适合金针菇的生长[1]。金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，金针菇的国内外市场日益广阔。金针菇含有人体必需氨基酸成分较全，其中赖氨酸和精氨酸含量尤其丰富，且含锌量比较高，对增强智力尤其是对儿童的身高和智力发育有良好的作用，人称“增智菇”。金针菇有增强机体对癌细胞的抗御能力，常食金针菇还能降胆固醇，预防肝脏疾病和肠胃道溃疡，增强机体正气，防病健身，还可抑制血脂升高，降低胆固醇，防治心脑血管疾病；抗菌消炎、清除重金属盐类物质、抗肿瘤的作用[2-4]。

金针菇作为我国重要的、普遍栽培的食用菌之一，对于金针菇次生代谢产物（黄酮类化合物）在国内系统的研究报道却较少。而对金针菇的研究大多集中在栽培技术、加工工艺及营养成分分析，而对其黄酮类化合物抗氧化性的研究未见报道。本试验以金针菇中总黄酮得率为考察指标，对影响金针菇总黄酮提取率的因素（乙醇浓度、提取时间、提取温度）进行了探讨，以得到金针菇总黄酮提取的条件优化，筛选出金针菇总黄酮提取的最佳实验条件。并采用DPPH法研究金针菇中黄酮化合物对DPPH自由基的清除作用。测定金针菇黄酮化合物的抗氧化性，以期为金针菇的进一步开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

金针菇：三明1号贵州六盘水市售。

二苯代苦味酰自由基（DPPH）：Sigma公司；抗坏血酸（VC）：广州日康食用化工有限公司；VE西安蓝天生物工程有限责任公司；芦丁（rutin）标准品：比利时进口，北京化学试剂有限公司；无水乙醇，Tris，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠等试剂均为市售国产分析纯。

1.2 仪器

UV-9100紫外分光光度计：北京瑞利公司；sartoriusBS110S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；FW80型高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 金针菇黄酮类化合物样品的制备[5]

1.3.1 金针菇黄酮类化合物的提取纯化方法

金针菇黄酮类化合物的提取：准确称取新鲜金针菇（65℃烘干至恒重）1 g，于烧瓶中加入30 mL 70%的乙醇，70℃水浴浸提2.5 h，过滤，并用70%乙醇定容至50 mL，得到金针菇黄酮提取液。

1.3.2 金针菇黄酮类化合物样品浓度测定

绘制标准曲线：称取在120℃干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL，使其浓度为100 μg/mL。将芦丁溶液用70%的乙醇稀释成 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于试管中，加70%的乙醇1 mL，加5%NaNO2溶液 0.3 mL，摇匀，静置 6 min，然后加 10%AL（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，最后再加4%NaOH溶液2 mL，摇匀，静置15 min~20 min后，于510 nm波长处测定吸光度A。

根据标准曲线的制作方法，以浓度（C，μg/mL）为横坐标，吸光值（A，510 nm）为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程：

金针菇黄酮类化合物样品含量的测定步骤：分别吸取1 mL样品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀释到刻度。分别取1 mL稀释液于试管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5%NaNO20.3 mL，混匀后静置6 min，加 10%AL（NO3）30.3 mL，混匀后静置 6 min，加 4%NaOH溶液2 mL，摇匀，静置10 min，同时以70%乙醇代替样品液配制空白试剂。在510 nm波长处测定吸光度A。

1.4 金针菇黄酮类化合物对DPPH自由基的清除实验[6-7]

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在517 nm处有强吸收，在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤电子被配对，使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关系。因此，可通过在此波长处吸光度的测定来评价自由基的清除情况。

DPPH溶液的配制:准确称取44 mgDPPH,用无水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,DPPH浓度为120 μmo1/L,避光保存（0℃～4℃）。

对照：0.1 mL无水乙醇与3 mL120 μmo1/L DPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30 min,以无水乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Ac。

将金针菇黄酮提取液分别取0.1 mL与3 mL 120 μmo1/L DPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30 min,以无水乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Ai,并以下式计算其清除率:

式中：Ac为0.1 mL无水乙醇加3.0 mL DPPH溶液的吸光度；Ai为0.1mL待测液加3.0mLDPPH溶液的吸光度。

按照上面公式计算清除率,清除率越大抗氧化能力越强。

2 结果与分析

2.1 金针菇黄酮类化合物样品浓度测定结果

根据试验所得标准曲线回归方程为Y=0.002616x-0.01314（式中Y为吸光度，x为浓度，（μg/mL）），见图1。

计算样品液浓度，结果如下：

在510 nm下测得金针菇黄酮提取液的吸光度Y=0.104，根据上述公式计算得到：x=44.775 μg/mL

2.2 对DPPH自由基的清除作用

分别取金针菇黄酮提取液 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL 分别加入 70%的乙醇 0.08、0.06、0.04、0.02、0 mL，作为不同浓度的金针菇黄酮类化合物的样品液，分别标示为样品1~样品5。

测得Ac=0.957，根据公式清除率/%=[（Ac-Ai）/Ac]×100%计算清除率，其结果如表1。

表1 不同浓度的金针菇黄酮提取液对DPPH的清除作用Table 1 Elimination of DPPH was trained on the different density of the Seeding of Tartary Buckwheat Flavonoids

由表1可知，金针菇黄酮提取液对DPPH具有较好的清除作用，且金针菇黄酮清除DPPH的能力随着加入量的增加而上升，即清除率与黄酮的用量存在着一定的量效关系。且在提取液浓度为44.775 μg/mL时，清除效果最好，达到17.24%。

2.3 不同抗氧化剂清除DPPH自由基的比较

由表1我们可知，金针菇黄酮提取液对DPPH的最佳清除浓度是44.775 μg/mL，将VC、VE分别配制成44.775 μg/mL的浓度，然后分别取金针菇黄酮提取液、VC、VE3 种抗氧化剂 0.1 mL 与 3 mL120 μmo1/LDPPH溶液加入同一试管中,摇匀,在黑暗中放置30 min,以无水乙醇为空白在517 nm测定其吸光度Ai，并分别计算其清除率，结果见下表2。