蜂王浆产品中10-羟基-2-癸烯酸的稳定性比较

2012-09-12党亚丽张中健闫小伟

食品研究与开发 2012年7期

关键词：蜂王浆脂质体内标

党亚丽，张中健，闫小伟

（浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州310013）

蜂王浆产品中10-羟基-2-癸烯酸的稳定性比较

党亚丽，张中健，闫小伟

（浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州310013）

10-羧基-2-癸烯酸（10－HDA）是蜂王浆特有的不饱和脂肪酸，在其质量标准中特别规定了含量要求。采用纳米技术制备纳米脂质体可提高其稳定性，以包封率为评定指标,采用乙醇注入-超声法制备了10-HDA纳米脂质体，并用液相色谱测定其中的10-HDA含量，比较5种蜂王浆产品中10-HDA的含量稳定性。结果发现，10-HDA纳米脂质体包封率可达98.3%，同时其含量最为稳定，而其它4种蜂王浆产品中10-HDA含量不稳定，随着时间的延长呈下降趋势。

10-HDA含量；蜂王浆产品；稳定性；脂质体

Abstract:10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA)is the special unstaturated fatty acid in royal jelly,which content is ruled in its quality.The lecithin as the main wall material,the 10-HDA nanoliposome was prepared by the ethanol injection-sonication method.Furthermore,five kinds of royal jelly product as the material,the content of 10-HDA was measured by HPLC,and then the 3 month-long stability experiment was carried out.Results showed that the envelope rate of 10-HDA may reach 98.3%using nanocapsule technology to prepare 10-HDA nanoliposome;simultaneously its content stability could be improved.While the 10-HDA content of other four kind of royal jelly production was unstable,the content became lower along with the time.

Key words：10-HDA content;royal jelly product;stability;nanoliposome

10-羧基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA）是蜂王浆特有的不饱和脂肪酸，占鲜王浆总量的1.4%~2.0%，是蜂王浆的标志物，在蜂王浆的质量标准中特别规定了王浆酸的含量要求。我国国家标准规定蜂王浆优等品中10-HDA含量应大于1.6%，合格品应大于1.4%[1]。日本从1980年起就采用了这一指标，并规定进口蜂王浆中王浆酸含量不得低于1.9%。

一直以来人们认为10-HDA具有一定的热稳定性[2]，在高温下其含量变化不明显[3]，近年来研究发现，10-HDA在蜂王浆产品中不稳定，如蜂王浆口服液中的10-HDA稳定性差[4]。李宪华[5]发现2001年~2002年在进出口蜂王浆胶囊中10-HDA稳定性差，这极可能在进出口时受限，造成经济损失。和健[6]研究表明，软胶囊成品冷藏时10-HDA的含量稳定，室温及高温高湿条件下其含量下降明显。但多年来，人们一直采用乙醚从新鲜王浆中抽提得到10-HDA，然后添加到蜂王浆产品中以提高10-HDA含量，对其稳定性方面的研究很少。

纳米脂质体是由脂质分子构成的双分子层囊泡，内水相可以包埋水溶性物质，双分子层可以包埋脂溶性物质。目前，Nafady等[7]制得了巴西蜂胶的β-环糊精包合物。纳米蜂王浆最先在日本出现[8]，它是以蜂王浆冻干粉与油脂一起混合制成粒状芯材，然后在其表面再包上一层被膜材料制成粒状蜂王浆，可长期保存，质量稳定。本文采用纳米脂质体将10-HDA包埋；并以5种蜂王浆产品为研究对象，采用液相色谱法对其中的10-HDA含量进行测定，比较其在蜂王浆产品中的稳定性，目前此方面研究鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

蜂王浆产品包括冻干粉、口服液、胶囊、含片；纳米脂质体制备所需材料：卵磷脂（EPC，生化试剂）；胆固醇：华东师范大学化工厂；吐温80（化学纯）；浙江省温州华侨化学试剂有限公司；10-HDA晶体粗品：江山日行蜂业合作社。

1.1.2 仪器

高效液相色谱仪WATERS 2690；检测器WATERS 996；分析柱 ZOBAX SB C184.6×250 mm；酶反应器：自制；501型超级恒温水浴：上海实验仪器厂；ZX98-1型旋转蒸发仪；上海有机研究所；VCX50型超声处理器（20 kHz）：美国 Sonics&Materials公司；CL20-B型冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.1.3 试剂

重蒸水、甲醇、磷酸二氢钾、浓磷酸、偏磷酸、无水乙醇、内标物（对羟基苯甲酸甲酯）、10-HDA标准品（纯度99%以上）。

1.2 10-HDA纳米脂质体的制备

1.2.1 原料提纯

称取10-HDA晶体粗品5 g置于250 mL三角瓶中，加入50mL水溶解，置200r/min摇床中振荡10min。用6 mol/L NaOH调溶液pH为10.0。振荡摇匀后加入50 mL乙醚 (Ⅰ)置200 r/min摇床振荡10 min提取杂质，置分液漏斗中静置3 h～4 h。取下层水液（乙醚层用旋转蒸发仪回收）用1∶1盐酸调pH（Ⅱ）至2.0，摇匀，加入50 mL乙醚（Ⅱ）置200 r/min摇床摇匀，静置过夜，充分提取10-HDA。用旋转蒸发仪回收乙醚得10-HDA浓缩液，加入5 mL~10 mL乙醇溶解，滤纸过滤，去除不溶于乙醇的杂质，置于平皿内晾干即得10-HDA 粗提品[9]。

1.2.2 提纯后原料的预处理

提纯后的10-HDA仍有少许不溶解于水，用乙醇溶解原料后离心，除去不溶于乙醇的物质，然后加卵磷脂和胆固醇，测定离心前后对10-HDA含量的影响。

1.2.3 脂质体制备方法

采用乙醇注入-超声法。称取卵磷脂（EPL）500 mg、胆固醇（Chol）100 mg、Tween 80300 mg及 50 mg癸烯酸晶体粗品，加入5 mL无水乙醇于55℃水浴至溶，边搅拌边用注射器快速将其注入50 mL 0.02 mol/L pH7.0磷酸缓冲液中，搅拌水化30 min，旋转蒸发除去乙醇（45℃，真空度0.1 MPa，迅速冷却，冰浴超声处理4 min（脉冲 1s/1s），4℃静置过夜，冷冻离心 30min（11000 g，4℃）后充入N2密封，置于冰箱冷藏保存[10]。

1.2.4 评价指标

评价脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等，其中包封率是衡量脂质体内在质量的一个重要指标。

其中液体介质中10-HDA含量的测定：采用正戊烷洗涤-HPLC法，即取5 mL纳米脂质体，加入5 mL正戊烷，漩涡混合3 min，2000 r/min离心5 min，取上层正戊烷液，重复操作一次，合并正戊烷液，氮气吹干后按照国标样品处理方法测定10-HDA的含量。

1.3 10-HDA测定方法及稳定性试验

1.3.1 样品处理

称取蜂王浆产品0.2g，称准至0.0002g置于25mL烧杯中，加预先混合1mL0.03mol/L盐酸溶液+2mL水+7 mL乙醇的溶液，搅匀，装入50 mL容量瓶，加25 mL乙醇，边加边轻轻摇动，加10.0 mL内标溶液，用乙醇定容，在漩涡混匀器上混合5 min，取出，3000 r/min离心 10 min 待测[11]。

1.3.2 测定方法

试样经乙醇处理，溶出10-HDA并沉淀蛋白质，加入内标后用乙醇定容,离心，取上清液进行测定。

液相色谱条件：检测波长为210nm；流动相为50%甲醇50%0.1%三氟乙酸；柱温35℃；流速1.0 mL/min；运行时间20 min；进样量2 μL（自动进样）。

标准溶液测定：精密称取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 10-HDA标准溶液至10 mL容量瓶中，加2.0 mL内标溶液，用无水乙醇定容，分别进样2 μL，用峰面积比值计算，应呈线性,求出校正因子F。

1.3.310 -HDA的计算

式中：F为校正因子；Ai为试样中被测组分峰面积；As为试样中内标峰面积；ms为内标质量，g；mi为试样质量，g。

1.3 .4 稳定性试验

将5种蜂王浆产品置于高温高湿环境中（40±2）℃，（75±5）%保存3个月测定。各进样2μL，重复测定3次，取3次平均值。

2 结果与分析

2.1 校正因子测定结果

在选定的色谱条件下，将10-HDA标准品配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 5 个质量浓度水平，每个质量浓度水平进样3次，取峰面积平均值。10-HDA的质量浓度在进样量为10 ng~1000 ng范围内与峰面积呈线性，校正因子F=1.287，标准曲线为：y=159606x-691.43，相关系数 r=0.998（n＝3）。

2.2 10-HDA含量的稳定性

5种蜂王浆产品中10-HDA含量典型的色谱峰见图1，其中D为冻干粉；K为口服液；J为胶囊；H为含片；N为纳米脂质体。稳定性结果见表1。

表1 蜂王浆产品中10-HDA稳定性试验结果Table 1 The stability of 10-HDA in the product of royal jelly

由表1可见，前4种蜂王浆产品中10-HDA含量不稳定，呈逐渐下降的趋势。这可能是由于10-HDA的结构中含有双键、羧基和羟基，双键可能发生不饱和脂肪酸的氧化；羧基可能会与氨基（美拉德反应中间产物）反应；羧基可能与多酚物质的羟基发生酯化反应等，因此，10-HDA易受空气、光线、水分和酸碱等影响产生稳定性方面的问题。

由表1计算可知，10-HDA晶体粗品纯度为44.12%，离心后为44.44%，表明用酸处理后离心对10-HDA的含量影响不大，原料经提纯后纯度为80.5%，因此选用离心处理用于纳米脂质体制备的原料。经计算，载量为10%的10-HDA纳米脂质体的包封率为98.3%，3个月的稳定性实验表明10-HDA含量几乎不变，说明纳米脂质体可提高10-HDA在蜂王浆产品中的稳定性。