利用口腔液对猪群健康进行管理
2012-09-12JeffreyZimmerman美国衣阿华州立大学教授
Jeffrey J.Zimmerman（美国衣阿华州立大学 教授）
利用口腔液对猪群健康进行管理
Jeffrey J.Zimmerman（美国衣阿华州立大学 教授）
人类使用自己的口腔液进行疾病诊断和健康评估已经有很长的历史，并且奠定了非常深厚的研究基础。如通过检测口腔液中的抗百日咳病毒IgG来诊断和监控儿童或青少年感染百日咳的情况，还有人采用PCR方法对口腔液中的人疱疹病毒6型进行定量分析，可见口腔液检测在人医中已经得到广泛应用。而艾滋病家用试剂盒的出现表明这套系统在人医的应用上达到顶峰。
而以采集口腔液为基础的健康监测系统能否用于养猪生产呢？2005年，美国衣阿华州立大学兽医诊断实验室对猪蓝耳病做持续监测研究。这项研究要求每两周对扁桃体采集一次样本，显然连续200多天地持续进行扁桃体涂样是不可能的。无奈之下，通过采集口腔液替代扁桃体涂样，来检测抗体并进行PCR试验。结果发现，抗体检测和PCR试验的结果都是阳性的。接下来的一系列试验证实，此方法不仅可以做疫病的持续监测，而且不受猪日龄的影响。该兽医诊断实验室2010年共检测样本11000份，2011年检测32517份，2012年预计能检测52000份以上。样本数的逐年增加说明检测结果是有效的。
1 口腔液的采集方法
采集口腔液的主要工具是棉绳，棉绳长约30cm。首先将棉绳挂在猪能接触到的地方，同时为了保持样本的清洁，棉绳悬挂的高度应以其末端位于猪的肩部为准，最好是猪抬头才能接触到的高度。研究表明，在25～30头猪的栏位里， 75%的猪在20～30分钟内会接触并咀嚼棉绳，因此完成采样工作需要20～30分钟。收集样本时，将被唾液润湿的一端棉绳（长约18cm）放入样本收集袋（如匀浆液过滤袋）中，剩下的部分剪掉。将袋子扎破，挤压袋子，将挤出的液体放入试管中，存于-20℃冰箱备用。
不同日龄的猪均可使用以上方法采集口腔液。对于年龄较小的猪，可以将棉绳放在地上任其玩耍，让它们知道棉绳无危险后，再将放在地上的棉绳扔掉，用挂起来的棉绳继续采集样本。除了棉绳，还可用麻绳和尼龙绳采集口腔液。研究表明，三种材料对ELISA的检测结果影响不大，但对PCR的检测结果影响较大，PCR试验必须使用棉绳采集口腔液。
2 用PCR方法检测口腔液中的病原
已有研究表明，PCR方法可以检测口腔液中的猪瘟病毒、猪圆环2型病毒 （PCV2）、 猪流感病毒、 蓝耳病病毒（PRSSV）等。Weesendorp等（2009年）检测了猪口腔液中的病毒TCID50（50%致细胞病变当量），这些猪感染了猪瘟病毒的不同毒株。结果发现，毒力较强的Brescia株在猪体内存在10天左右就会导致猪只死亡，而毒力较弱的Zoelen毒株在猪体内存活的时间较长，病毒接种54天后仍可检测到（图4）。Prickett等（2011年）利用定量PCR检测了接种的PCV2病毒在猪唾液中的量和持续时间。结果表明，该病毒在接种猪后的第2天即可被检测到，并且在接种98天后仍然可以检测到，浓度为1×105.6拷贝/mL。Allerson和 Torremorell（2012年）使用RT-PCR方法比较了生长育肥猪的鼻腔样中和口腔液中的猪流感病毒情况，试验16天以内能在鼻腔涂样中检测到流感病毒，而到试验第69天都可以在口腔涂样中检测到流感病毒 （图 5）。Kittawornrat等（2010年）将24头成年公猪分成三组，分别接种PRSSV疫苗、1型PRSSV野毒和2型PRSSV野毒，采用qRT-PCR检测了口腔液中的PRSSV，发现接种后21天，所有的口腔液样品均表现为阳性。
3 口腔液中的抗体检测
人医可利用口腔液进行传染性疾病的诊断，大部分诊断是基于抗体的检测。这主要有以下三个原因：一是抗体检测相对于PCR检测更廉价；二是通过口腔液检测抗体的技术较成熟；三是抗体检测的重复性更好。
血清抗体分析的大部分试验都可以进行简单的优化，转变为用来检测口腔液中抗体的试验方法，如改变培养时间、试剂的稀释倍数、阴性和阳性的阈值设定等。Prickett等（2011年）用PCV2接种猪，接种后14～98天在猪的口腔液中均检测到抗PCV2抗体，如IgG、IgM和IgA。口腔液中抗PCV2的IgG和IgA浓度在不同的猪只之间差异不显著，在接种后14～21天开始检测到，到试验结束时仍能检测到这两种抗体（图6）。而抗PCV2的IgM在不同接种动物的口腔液中浓度差异显著，接种后14天开始一直到试验结束时均能检测到这个抗体。Panyasing等研究发现猪接种猪流感病毒后，在接种后7天即可从口腔液中检测到猪流感病毒的核蛋白抗体，与未接种的猪形成明显的差异。Kittawornrat（2012年）将检测抗PRRSV抗体的商业用ELISA试剂盒进行改造，用于检测口腔液中的抗体，结果发现人工接种PRRSV的试验猪口腔液中很容易检测到IgM和IgA，商品场则很难检测到这两种抗体，而无论是试验猪群还是商品场猪群，均很容易检测到IgG，并且其检出量达到了诊断水平。若将样本阳性阈值设定为≥0.40，利用受试者操作特征进行分析估算，得到该方法的诊断灵敏度和特异性分别为94.7%和100%。但由于监测需定期收集样本，重复次数较多，对灵敏度的要求不是很严。可见，ELISA检测口腔液中的抗PRRSV IgG可用于监测商品猪场的PRRSV流行情况。
4 总结
在兽医临床上，我们需要对地方病和外来病进行更好的监测，以做好疫病的防疫工作。在养猪生产中，使用优化的PCR方法可以对口腔液中的很多种病原进行检测。同样，基于口腔液的抗体检测方法也可以逐渐被开发出来，且使用口腔液监测比血清学监测在养猪生产中具有明显的优势。
