高效液相色谱法测定头孢呋辛酯中高分子聚合物

王 玲，胡朝新，陆红彬，冯晓燕

苏州致君万庆药业有限公司，江苏太仓 215415

β-内酰胺类抗生素是目前临床上最常用的抗感染药物，但其常易引发过敏反应，甚至过敏性休克，威胁患者的生命安全。多年的研究已证明，抗生素所致的速发型过敏反应并非由药物本身所致，而是与药物中存在的高分子杂质有关[1]。此外，一些抗菌药物（如链霉素、某些头孢菌素）中的高分子杂质，还和药物的毒性反应有关，故对抗菌药物中高分子杂质进行控制具有重要的意义[2]。《中国药典》对众多抗生素制定了高分子聚合物检测方法，例如:头孢尼西钠、头孢呋辛钠、头孢替唑钠、头孢噻吩钠等；其中《中国药典》2005版二部[3]收载了11个品种21个聚合物检查标准，2010版二部[4]在此基础上收载了21个品种42个聚合物检查标准。头孢呋辛酯为脂溶性样品，《中国药典》2010版、USP 32版[5]、日本药典JPⅩⅤ[6]及EP6.0[7]均收载了该品种，但均未对该药中的高分子杂质进行控制。通过调研，采用聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物（分子量使用范围＜10000）为填充剂的色谱柱进行试验，成功对头孢呋辛酯中的高分子聚合物进行分离分析，为该药的质量控制提供了新的检测方法，保证了药品质量。

1 材 料

1.1 仪器

岛津LC-20A型高效液相色谱仪（含LC-20AT型高压输送泵、SPD-20A型紫外检测器、LC-solution色谱工作站）。

1.2 试药

二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（国药集团化学试剂有限公司，色谱纯）；无水溴化锂（A Johnson Matthey Company）；头孢呋辛酯对照品（批号:130492-200402，中国药品生物制品检定所，纯度:80.8%）；头孢呋辛酯样品（本公司自制，批号:090901、090902、090903）；头孢呋辛酯胶囊（英国葛兰素史克公司，商品名:西力欣誖，批号:C419105）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为TSK凝胶柱G2000 HHR（7.8 mm×300 mm）；流动相:0.030 mol·L-1LiBr溶液（称取 Li-Br 2.6 g，加二甲基甲酰胺溶解并稀释至1000 mL）；流速:0.33 mL·min-1；检测波长:280 nm；进样量:20 μL；柱温:室温。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取头孢呋辛酯样品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中含头孢呋辛酯（无水物计）0.2 mg的溶液。

2.2.2 对照溶液 精密量取供试品溶液1 mL，置

100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

2.3 系统适用性试验

2.3.1 空白溶剂的选择 分别采用二甲基甲酰胺（DMF）、流动相为空白溶剂进行试验，结果发现采用DMF为空白溶剂时，在主峰出峰位置后（约25 min处）有一明显倒峰，影响聚合物测定，而空白流动相无任何杂质峰出现，不影响测定结果，故确定采用流动相为空白溶剂，用以配制供试品溶液。见图1。

图1 不同溶剂的HPLC色谱图

2.3.2 系统适用性试验 精密量取对照溶液20 μL，连续进样6次，考察峰面积的相对标准偏差。试验结果显示，其峰面积RSD为1.4%（＜4.0%），符合要求。见图2。

图2 对照溶液的HPLC色谱图

再精密量取对照溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，主峰面积应为上述对照溶液主峰面积的20%～40%。结果灵敏度测定主峰面积为122606，为对照溶液主峰面积的29.9%，符合要求。试验表明，本色谱条件下，系统适用性良好。

2.4 聚合物重复性试验

精密称取头孢呋辛酯（批号:090901）10 mg，共6份，分别置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，立即精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以聚合物测定结果计算相对标准偏差。结果表明，6次测定聚合物峰面积分别为61743、65772、63630、65346、67622、68762，RSD 为 3.1%（＜5.0%），重复性良好。

2.5 供试品溶液浓度与聚合物测定结果的相关性考察

精密称取3份同批次供试品（批号:090901）10、20、30 mg，分别置 3 个 100 mL 量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，立即精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积Y为纵坐标，以浓度X（mg·mL-1）为横坐标，按最小二乘法进行线性回归。结果头孢呋辛酯在0.104～0.304 mg·mL-1范围内，溶液浓度与聚合物峰面积呈良好的相关性，线性回归方程为 Y=3.536×105X-3.182×103（r=0.9998）。

2.6 对照溶液的最低检测限与定量限

取头孢呋辛酯对照品，用流动相溶解并逐步稀释至浓度为 0.0081 μg·mL-1时，精密量取 20 μL 注入液相色谱仪，记录的色谱图中主峰峰高约为基线噪音的10倍，计算本品的定量限为0.162 ng；再逐步稀释至浓度为0.0034 μg·mL-1时，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录的色谱图中主峰峰高约为基线噪音的2～3倍，计算本品的检测限为0.068 ng。见图3。

图3 头孢呋辛酯最低检测限色谱图

2.7 破坏试验

由于本色谱系统为无水系统，无法进行酸、碱、氧化破坏试验，为考察头孢呋辛酯聚合物受外界条件变化情况，设计如下试验:取头孢呋辛酯样品（批号:090901）适量，置敞口量瓶中，分别在高温60℃、强光4500lx、高湿75%条件下放置10天，考察聚合物变化情况，结果见表1。

表1 头孢呋辛酯破坏试验聚合物测定结果（%）

试验结果表明，头孢呋辛酯聚合物在高温及高湿条件下略有增加，在光照条件下增加较快，说明本品对光照较为敏感，应避光保存。同时，上述破坏条件下高分子聚合物与主峰均能有效分离，表明本色谱系统专属性良好。

2.8 样品聚合物测定

取3批供试品、进口头孢呋辛酯胶囊（西力欣誖）、头孢呋辛酯对照品、国内其他厂家生产的头孢呋辛酯原料，分别以峰面积归一化法、不加校正因子的自身对照法，计算供试品中聚合物的量，结果见表2、图 4。

表2 头孢呋辛酯聚合物测定结果（%）

图4 头孢呋辛酯聚合物检查供试品色谱图

3 讨 论

3.1 色谱柱的选择。由于头孢呋辛酯为脂溶性样品，不溶于水及相关助溶剂，无法采用常规的sephadex G-10型葡聚糖凝胶柱进行试验，通过比较，试验采用日本TOSOH公司生产的TSK凝胶柱G2000 HHR进行试验。结果表明，该色谱柱可以有效检测出头孢呋辛酯样品中的高分子聚合物。

3.2 杂质计算方法。样品检测结果表明，采用峰面积归一化法、不加校正因子的自身对照法，两种计

算方法分别测得的头孢呋辛酯聚合物量结果一致。考虑到试验所用溶剂为二甲基甲酰胺（色谱纯），价格较为昂贵，回收处理困难，易造成环境污染；供试品溶液浓度与聚合物测定结果的相关性考察试验结果也表明，供试品溶液在0.104～0.304 mg·mL-1范围内，溶液浓度与聚合物峰面积呈良好的线性关系，故试验可以采用峰面积归一化法来计算供试品中聚合物的量。

3.3 聚合物的形成是一个动态的过程，聚合物的含量会随时间的延长而增大，故检测聚合物含量时应在溶液配制后立即进样。

3.4 该方法适用于检查头孢呋辛酯原料及相应制剂中的聚合物含量，如头孢呋辛酯片、头孢呋辛酯胶囊，同时也适用于检测其他不溶于水的酯类药物中聚合物量，如头孢卡品酯、头孢泊肟酯等，为该类脂溶性药物提供了一种聚合物控制手段。

[1]金少鸿，胡昌勤.β-内酰胺类抗生素过敏反应的研究进展[J]. 中国新药杂志，1994，4（3）:38.

[2]胡昌勤，金少鸿.β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质及其分析技术研究进展 [J].国外医药·抗生素分册，1996，17（5）:336.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部[S].北京:北京化学工业出版社，2005:142.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部[S].北京:中国医药科技出版社，2010:191.

[5]The United Statespharmacopeia convention.United States pharmacopeia 32-NF27[S].2009∶1863.

[6]Japanese pharmacopeiaⅩⅤ[S].2006∶474.

[7]European directorate for quality medicines.European Pharmacopeia 6.0[S].2008∶1463.