饲粮ω－6/ω－3多不饱和脂肪酸比例对鹅肝脏过氧化脂质和肝细胞超微结构的影响

丁洛阳 蔡缪荧 王梦芝 喻礼怀

(扬州大学动物科学与技术学院，扬州 225009)

过量的氧自由基可引起神经元胞体的损伤，使脑内总RNA和蛋白质含量下降，神经元密度降低，造成动物学习记忆能力下降及机体的衰老。而随着现代社会的发展，抗氧化、抗衰老和亚健康状态等越来越为人们所关注［1］。研究认为，ω－3系列多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)具有清除自由基、提高超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶活性、降低过氧化脂质水平、抗衰老等功能［2］。ω－6、ω－3 系列 PUFA 在机体的代谢过程中相互竞争，其合理比例的摄入，对于机体抗氧化、抗应激能力的提高及健康状态的维持至关重要。但迄今为止，畜禽饲粮中 ω－6/ω－3 PUFA比例的合理范围尚未确定，且关于其比例对担负着代谢、解毒、抗氧化等功能的重要器官——肝脏的影响规律的研究尚不多见［3］。扬州鹅是由扬州大学、扬州市农林局以太湖鹅为母本选育而成，于2006年通过国家畜禽品种委员会审定的品种。目前对于该品种的研究主要涉及其生产性能及营养需要等［4－6］，而关于 ω－6/ω－3 PUFA 比例对该品种肝脏抗氧化功能的影响尚无报道。本试验以扬州鹅为研究对象，通过饲喂4个梯度的ω－6/ω－3 PUFA比例饲粮进行饲养试验，研究其对肝脏过氧化脂质和肝细胞超微结构的影响，旨在探讨ω－6/ω－3 PUFA比例影响肝脏抗氧化功能的规律与机理，并为生产实践中扬州鹅的科学饲养和油脂饲料的合理使用提供理论参考，同时也为理想脂肪酸模式的研究提供一些基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

从江苏省高邮市扬州鹅养殖基地选择160只同批出雏、体质健壮、体重(0.407±0.023)kg、饲养管理一致的21日龄扬州鹅苗，随机分成4组，每组4个重复，每个重复10只，公母各占1/2。饲粮经7 d过渡为试验饲粮，29日龄开始正式试验。4组试验鹅分别饲喂 ω－6/ω－3 PUFA 比例为 12∶1、9∶1、6∶1、3∶1 的试验饲粮，参考我国研究者对扬州鹅营养的研究［4－6］及 NRC(1994)［7］标准配制饲粮，试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

1.2 样品采集与处理

试验鹅饲养至42、56和70日龄时，每组分别随机取8只，空腹24 h进行屠宰测定，5 min之内快速完成屠宰、采血，迅速在冰盘上分离得到肝脏，即时进行样品处理和指标测定。

组织匀浆:取肝脏组织用5%的生理盐水匀浆，匀浆液在4℃下以3 000 r/min离心10 min，取上清液待测。

电镜切片:迅速于肝最大叶距边缘5 mm处切取肝组织，于25%的戊二醛固定液中预固定10 min，取出切成1 mm3见方的组织块数块，放入25%戊二醛中固定。24 h后更换1次固定液，而后送至扬州大学电镜中心制作电镜超薄切片。

1.3 指标测定与方法

在4℃条件下将匀浆液以10 000 r/min离心10 min，取上清液稀释成1%后，以考马斯亮蓝蛋白质试剂盒测定组织蛋白质含量。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定。具体操作按试剂盒说明进行，测定所用试剂盒购自南京建成生物公司。

一氧化氮(NO)含量采用 Griess法［8］测定。将不同浓度的亚硝酸钠磷酸盐缓冲溶液40 μL，加入到160 μL的Griess试剂(0.1%萘乙二胺溶液与1%的磺胺5%磷酸溶液)中，混匀静置20 min，550 nm波长测定溶液光密度(OD)值。以亚硝酸钠浓度为横坐标，OD值为纵坐标做标准曲线。取样品40 μL进行测定，根据标准曲线计算 NO含量。

1.4 肝细胞超微结构观察

参照李翔［9］的试验方法进行。样品于2.5%戊二醛中固定2 h，0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗2～20 min。0.1%锇酸固定30～120 min，0.1 mol/L磷酸缓冲液清洗。再按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮(2次)各5 min梯度脱水。丙酮与环氧树脂1∶1混合浸透2 h，纯环氧树脂包埋剂浸透2 h包埋，80℃恒温箱内10 h聚合，超薄切片机切片，经醋酸双氧铀和枸橼铅双重染色各10 min染色后，透射电镜观察，拍照记录。在每例肝脏样品的电镜图片中选取清晰图片，每幅图片中平均选取5个不重叠的视野，每个视野测定10个完整的线粒体面积，以其平均值作为该例线粒体的面积。

1.5 数据处理与统计分析

采用Excel 2003软件处理数据和作图，采用SPSS 16.0软件的one－way ANOVA过程进行单因素方差分析和Tukey多重比较。P＜0.05为差异显著判断标准。

2 结果与分析

2.1 ω-6/ω-3 PUFA比例对肝脏MDA、NO含量的影响

由图1可知，扬州鹅肝脏组织MDA的含量随日龄的增加呈上升趋势，以70日龄较高，升高的幅度以 12∶1 和9∶1 组较大，而 3∶1 和 6∶1 组较小。各组间的比较可见，在各个检测日龄，扬州鹅MDA含量都有随ω－6/ω－3 PUFA比例的降低呈现下降的趋势;其中3∶1和6∶1组显著低于其他2组(P ＜0.05)，但3∶1 和 6∶1 组之间及 9∶1 和 12∶1 组之间均差异不显著(P＞0.05)。

图1 ω-6/ω-3 PUFA比例对肝脏MDA含量的影响Fig.1 Effects of ω－6/ω－3 PUFA ratio on liver MDA content

由图 2可知，NO 含量随 ω－6/ω－3 PUFA 比例的降低呈下降的趋势，各日龄皆以3∶1组最低。其中42日龄时，3∶1和6∶1组显著低于其他2组(P ＜0.05)，但3∶1 和 6∶1 组之间及 9∶1 和 12∶1 组之间均差异不显著(P＞0.05)。56日龄时以12∶1组最高，显著高于其他3组(P＜0.05)。70日龄时以12∶1组最高，显著高于其他3组(P＜0.05);9∶1和6∶1组次之，这2组也显著高于3∶1组(P＜0.05);但9∶1 和 6∶1 组间差异不显著(P ＞0.05)。

2.2 ω-6/ω-3 PUFA比例对肝细胞超微结构的影响

由图3可见，3∶1和6∶1组肝细胞胞核较圆且居中，核仁明显;细胞质内糖原颗粒、线粒体和粗面内质网清晰可见，少见脂滴，线粒体数量较多，内脊呈短管状且排列规则。9∶1和12∶1组肝细胞胞核椭圆、扁圆或不规则，核膜内溢溶解的较为严重，核仁不明显;胞质内的内质网略见扩张;线粒体可见明显肿胀，嵴断裂或消失且排列不规则;糖原颗粒及其他细胞器未见有异常的情况，但数量有所减少。由表2可见，各组肝细胞线粒体平均面积以 12∶1 组最大，其他次依次为 9∶1、6∶1、3∶1组，但差异不显著(P＞0.05)。

图2 ω-6/ω-3 PUFA比例对肝脏NO含量的影响Fig.2 Effects of ω－6/ω－3 PUFA ratio on liver NO content

图3 肝细胞超微结构图Fig.3 The ultra－structure of liver cells

表2 肝细胞线粒体平均面积Table 2 The average area of mitochondria in liver cell μm2

3 讨论

自由基是指在最外层轨道中含有未配对电子的原子、原子团或特殊状态的分子，即具有未配对电子的原子、原子团、分子或离子。机体在有氧代谢过程中产生超氧阴离子自由基(O－2·)，进而产生羟基自由基，其极强的氧化反应能力可使各种生物膜的不饱和脂肪酸发生过氧化，形成过氧化脂质。进而使蛋白质分子内和分子间发生交联，DNA的双旋交联出现错误或无法分裂，影响细胞的正常生长、代谢。过量的氧自由基可损伤神经元细胞，而减退动物学习记忆能力、促进机体的衰老［10］。正常情况下，细胞内存在一系列抗过氧化物酶，可清除过氧化脂质而减轻氧化损伤［11］。脂质中含有的不饱和脂肪酸与氧自由基有高度的亲和性，因此，脂质最易受自由基的氧化损伤而产生过氧化脂质产物 MDA［12－13］。MDA 具有细胞毒性，可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联，导致细胞损伤，炎症介质的释放。龙建纲等［14］研究报道，MDA对线粒体呼吸、丙酮酸脱氢酶、α2酮戊二酸脱氢酶等具有显著的抑制作用。NO与O－2·作用形成毒性较强的氧化亚硝酸根自由基，可使蛋白质或酶失活，抑制呼吸链酶，破坏线粒体结构，引起组织氧化损伤［15］。因而，MDA与NO含量能反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞膜系统损坏程度［16］。

研究表明，ω－3 PUFA不仅能直接清除自由基，还提高SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)等抗氧化酶的活性，从而有效地去除自由基和过氧化脂质，起到保护细胞免受氧自由基损伤的作用［2］。本研究表明，鹅肝脏MDA、NO含量随日龄的增加呈上升趋势，并以70日龄的相对较高，这符合机体生长的规律，与在健康和正常状态下，随年龄的增加机体自身的抗氧化能力逐渐下降并基本一致。各组间比较又发现，肝脏MDA、NO含量随ω－6/ω－3 PUFA比例的降低呈现降低的趋势。其中，3∶1和6∶1组极显著低于其他2组，表明了饲粮ω－6/ω－3 PUFA比例较低时，可有效提高扬州鹅肝细胞去除过氧化脂质物的能力，改善细胞的抗氧化和抗衰老能力。

在某些因素影响下，自由基的生成过多，氧化/抗氧化系统失衡，影响细胞膜的变形能力和流动性，进而导致细胞的损伤［17］。本研究通过肝细胞超微结构观察发现，扬州鹅肝细胞的变化以膜系结构(线粒体和内质网等)为主，与郭晓英等［18］、莫志亚等［19］关于大鼠，何海健等［20］关于仔猪，龚涛等［21］关于雏鸡的报道结果基本一致。本研究还发现，饲粮ω－6/ω－3 PUFA比例较高组的扬州鹅肝细胞胞质内糖原颗粒有所减少，线粒体膜系结构变化较大。这可能是由于较高 ω－6/ω－3 PUFA比例组肝细胞去除自由基的酶活性下降，去除自由基过氧化能力减弱，而且胞质中存留较高水平的NO与O－2·，进而形成毒性较强的氧化亚硝酸根自由基，抑制呼吸链酶，破坏线粒体结构所致;另外，还可能与其较高含量的过氧化脂质产物MDA攻击细胞生物膜系统，使之线粒体受损所致。

4 结论

饲粮 ω－6/ω－3 PUFA 比例较低的 3∶1 和6∶1 组能够明显降低生长期扬州鹅肝脏MDA、NO含量，减少肝细胞膜系结构的损伤，改善其抗氧化状态。

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