聚驱后油藏产多糖微生物多样性与功能分析

董 浩，佘跃惠，王正良，舒福昌 （长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州434023）

张 凡，柴陆军 （中国地质大学（北京）能源学院，北京100083）

聚驱后油藏产多糖微生物多样性与功能分析

董 浩，佘跃惠，王正良，舒福昌 （长江大学化学与环境工程学院，湖北荆州434023）

张 凡，柴陆军 （中国地质大学（北京）能源学院，北京100083）

通过16SrDNA克隆建库方法对大庆北二西油藏微生物调剖过程中和调剖后4个不同油井（B2－D4－P45井、B2－4－P47井、B2－4－P49井和B2－5－51井）3个不同时间段的样品经选择富集后的产多糖微生物群落进行研究。结果表明，主要的产多糖菌为爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）和爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis），经分离纯化得到一株纯菌DT－1，与爱媛类芽孢杆菌的16SrDNA序列同源性达到99%。调剖过程中主要激活了3类产多糖菌，调剖1年后微生物多样性明显增加，产生物表活剂菌和降解石油烃菌都被共同激活。

聚驱后油藏；产多糖菌；16SrDNA克隆文库；爱媛类芽孢杆菌；微生物调剖

微生物提高石油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR）是生物工程技术在油田开发领域开拓性的应用，以其成本低、适应性强、作业简单、对地层无伤害和环保友好性等优势，尤其是它可以用于聚合物驱油后的油藏和枯竭油藏的强化采油，在世界上引起广泛重视，近年来成为石油开采技术中的热点［1］。微生物调剖（Microbial plugging）技术是通过注入产多糖微生物或激活地层产多糖本源微生物，微生物的生长代谢产生的胞外聚合物、无机盐沉淀以及细胞本身在岩石孔隙表面积累起生物膜，能有效封堵喉道；另外，营养剂注入地层后优先通过高渗透带，激活处于高渗透带的产多糖本源菌生长，高渗透带渗透率降低，从而扩大注水波及面积，达到调剖和提高采收率的目的。美国1984年开展了在聚合物驱后注入各种微生物调剖的试验［2］，国内大港油田1995年在港西四区的井组进行了聚合驱后微生物驱的先导性矿场试验，均取得了一定的效果［3］。

目前大庆油田大规模采用聚合物驱等三次采油技术提高采收率，聚驱后油层不仅含有约50%的剩余油，还有部分聚合物被吸附和滞留在岩石孔隙及表面上，大量井因高含水或水淹而被迫关井。而环保无污染、能源消耗少和吸附引起的化学剂损失小的MEOR技术是聚驱后开采残余油的一种经济有效手段。因而研究聚驱后油藏产多糖微生物群落，分离适合聚驱后油藏特征的调剖功能菌及开发相应的调剖技术对延长大庆油田等以聚合物驱为主的油田的开采寿命具有重大意义。

笔者采用16SrDNA克隆文库研究大庆北二西油藏聚驱后产多糖微生物多样性，并选择性分离产多糖菌，为开展微生物调剖提供基础资料。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 试验水样

11个油水样为北二西油藏微生物调剖过程3个不同时期样品（表1），该油藏地层温度为45℃，原始地层压力为10．91MPa，饱和压力9．83MPa，破裂压力13．1MPa，地层水矿化度7000mg／L，油层地下原油粘度9．3mPa·s，平均单井砂岩厚度19．9m，有效厚度12．1m。2008年11月至2009年6月期间在该油藏开展微生物调剖试验，试验区示意图如图1所示。B2－4－P47井2009－02样品缺失，2009－05样品用B2－D4－P47井代替。

表1 2009～2010年产多糖菌克隆文库对应油井以及采样时间编号

1．1．2 主要药品和仪器

TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒；DNA纯化试剂盒；dNTP；DNA marker（TaKaRa）；27f（5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′）；1492R（5′－GGC TAC CTT GTT ACG ACT T－3′）；pGEM－T easy vector system（Promega）。

钢丝绳走线分析:基本单元四边形N1N2F2F1、M1M2E2E1两组角线变化基本相同，且单调递增，可以依据曲线变化设计钢丝绳走向。

Sigma 3K15型冷冻离心机；PTC－200型PCR仪；DYY－5C型电泳仪；Gel－Pro2020D型荧光成像仪；LRH－250生化培养箱。

1．1．3 培养基

产生物多糖聚合物的培养基为糖类2%，磷酸二氢钾0．2%，硫酸镁0．1%，硫酸铵0．1%，微量元素适量，pH值为7。

1．2 产多糖微生物的分离

在产多糖培养基中接入5%的样品，45℃，200r／min培养4d；然后转接富集培养，重复10轮，挑取产多糖效果较好的3组发酵液分离纯菌，将分出的纯菌做斜面保存。

1．3 可培养产多糖聚合物微生物群落的分析

具体方法参见文献［4］。

2 试验结果

2．1 ARDRA结果和测序结果分析

将不同克隆文库中OTU的代表克隆测序，所得序列在GenBank数据库中作对比分析。结果表明，在B2－D4－P45井3次取的样品中优势菌为爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）和爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis），在A1中所占比例分别为64%、25%，A2中分别为11%、47%，A3分别为44%、38%。这几组样品富集液的粘稠度较高，初步推断产多糖菌为这一类的芽孢杆菌。该文库中微生物的种类少，除了芽孢杆菌和类芽孢杆菌类，在A1中发现了少量的副球菌（Pannonibacter phragmitetus，1%）和未培养细菌（Uncultured bacterium，4%），A2中有少量耐盐弧菌（Vibrio vulnificus，1%），A3中由少量铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，1%）和未培养细菌（Uncultured bacterium，2%）。

在B2－4－P47井B2样品中，优势菌为爱媛类芽包杆菌（Paenibacillus ehimensis，76%）和爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis，21%），富集液的粘稠度较高。在B3中占主导地位的是γ变形菌（Gamma proteobacterium，59%）、红球菌（Rhodococcus qingshengii，26%）；此外还有少量的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida，7%）和未培养细菌（Uncultured bacterium，2%）。

在B2－4－P49井3次取得样品中，C1、C2优势菌均为芽孢杆菌（Bacillus sp．）、爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis）所占比例分别为52%、30%和49%、21%，C2中还有少量副球菌（Pannonibact－er phragmitetus，5%），在C3中优势菌为类芽孢杆菌（Paenibacillus，54%），爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis，34%），这3组富集液均粘稠。

在B2－5－51井3次取的样品中，D1优势菌为芽孢杆菌（Bacillus sp．，53%）和爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis，44%）；D2优势菌为戴沃斯菌（Devosia sp．，59%）和嗜麦寡养食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，28%），另外有少量的无色菌（Achromobacter sp．，2%）、雌激素降解菌（Estrogen－degrading bacterium，5%）和未培养细菌（Uncultured bacterium，5%）；D3优势菌为土壤根癌杆菌（Agrobacterium tumefaciens，94%），此外有少量短波单胞菌（Brevundimonas sp．，1%）、芽孢杆菌（Bacillus siralis，1%）和未培养细菌（Uncultured bacterium，4%）。

2．2 产生物多糖聚合物菌的分离鉴定

通过稀释涂平板和划线分离的方法分离得到一株单菌DT－1。将菌株DT－1的16SrDNA序列与GenBank中核酸数据库进行同源性比较，结果表明该菌株与爱媛芽孢杆菌（Bacillus ehimensis）同源性最近，达到了99%，被归为类芽孢杆菌属，命名为Paenibacillus ehimensis［5］。

3 讨 论

通过选择性富集培养和建立16SrDNA克隆文库的方法，分析了大庆北二西聚驱后油藏产出液中可培养产聚合物微生物群落组成。实施微生物调剖期间，2009年2月和2009年5月样品OUT都较少，富集发酵液中的优势菌群大量集中在3个条带上，说明微生物调剖注入产多糖类激活剂主要激活了3类菌。而调剖试验1年后，注入的产多糖激活剂基本上被消耗完了，因此2010年6月样品富集后的微生物种类较多。对比11组试验结果发现，富集液粘稠，且产生白色不溶物质多的8组样品中的优势菌均为爱媛类芽包杆菌（Paenibacillus ehimensis）或芽孢杆菌（Bacillus sp．）；而另外3组发酵液粘稠度较低，产生的白色不溶物质较少，他们的优势菌为γ变形菌（Gamma proteobacterium，59%），红球菌（Rhodococcus qingshengii），土壤根癌杆菌（Agrobacterium tumefaciens，94%），戴沃斯菌（Devosia sp．，59%），所以判断主要的产多糖菌为芽孢杆菌属。

在富集液粘稠且产生白色不容物质多的8组样品中选取1组分离单菌，对产多糖菌的分离及分子学鉴定结果显示，分离出的单菌为爱媛类芽孢杆菌；在产多糖培养基中接入该单菌培养，发酵液变粘稠，产生大量不溶白色物质，推断爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）为主要的产多糖菌。爱媛类芽孢杆菌（Paenibacillus ehimensis）属于厚壁菌门，能产生几丁质酶和其他的水解酶，并能溶解B．sorokiniana细胞壁［6］。

在A3样品中发现了少量的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginos），铜绿假单胞菌可以降解烷烃、脱硫、脱氮和产生表面活性剂降低稠油粘等，是很常见的微生物采油菌，在很多取自不同油田的样品中均有发现［7］。短波单胞菌（Brevundimonas sp．）是一种烃降解菌，以往的相关研究表明，该区块聚驱后产出液中短波单胞菌、铜绿假单胞菌等采油功能菌在群落中占主导地位［8］。该次研究中也发现了短波单胞菌（Brevundimonas sp．，5．68%），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginos，1．12%），与以往不同，这些菌在群落中占的比例很小，推测其原因为在产多糖培养基中，在和芽孢杆菌的竞争中处于了劣势，但又能够在该培养基中存活。D3优势菌为土壤根癌杆菌，土壤根癌杆菌能够降解二苯并噻吩（DBT），能够用于石油脱硫和环境修复。

在发酵液D2中还检测到嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，26．4%），该菌为专性需氧的非发酵型革兰氏阴性极生多鞭毛杆菌，能够分解利用葡萄糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、麦芽糖、纤维二糖、乳糖等24种物质产酸，在血平板上有强的氨味，呈β溶血；在营养琼脂上显示灰黄色素或无色素，菌落呈针尖状，直径0．5～1mm，中央突起。还原硝酸盐为亚硝酸盐，氧化酶阴性，强解脂性，DNase阳性，水解明胶和七叶苷，赖氨酸脱羧酶阳性。有关该菌用于石油开发的报道很少，张竹圆等［9］2011年在辽河样品中分出该菌，研究表明该菌具有耐碱性，pH适应范围为5～10，同时也有较好的耐盐性和耐低温性，对C8～C26范围内的正构烷烃均有较强的降解作用［10］。

红球菌（Rhodococcus qingshengii）在B3占有较高的比例，达到33%，该属中的Rhodococcus aurantliacus，Rhodococcus erythropolis（红串红球菌）等均能产生一种表面活性剂海藻糖脂，具有较好的驱油性能和洗油效率［11］。其中红串红球菌为专一性脱硫菌，能选择性地脱除苯并噻吩（BT）和DBT及其甲基衍生物4，6－二甲基二苯并噻吩（4，6－DMDBT）中的硫。除此之外，它还可以脱除苯硫醚（PS）和硫醇类含硫化合物中的硫。在正十六烷模拟体系中菌株对噻吩（TH）、4，6－DMDBT、DBT等类型的硫的降解效率很高，对BT和PS类硫的降解效率也较好［12］。

11组样品中微生物的种类都比较少，可能由于大庆油田处于开发后期，油井高含水，聚合驱也导致产出液中含有高浓度的聚合物，这些导致能适应该环境的微生物种类较单一；经过选择性培养后能生长的微生物进一步减少。经过产多糖培养基选择富集后的微生物群落较单一，但占优势地位的多种微生物均为采油功能菌，比如能产生胞外聚合物的爱媛芽孢杆菌，能产生表活剂以及脱硫的红球菌，能降解石油和还原硝酸盐的嗜麦芽寡养单胞菌等。

4 结论

1）用16SrDNA克隆建库方法对大庆聚驱后北二西油藏产出液选择富集后的产多糖微生物群落进行研究，表明爱媛类芽孢杆菌等为主要的产多糖菌。

2）分离出了一株产多糖菌DT－1，经鉴定为爱媛类芽孢杆菌。

3）其他产多糖微生物为土壤根癌杆菌、红球菌、嗜麦芽寡养单胞菌等。此外共生的菌有产生物表活剂和降解烃类微生物如铜绿假单胞菌、短波单胞菌、恶臭假单胞菌。

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［编辑］ 宋换新

TE327；Q785

A

1000－9752（2012）05－0112－04

2011－12－12

国家“863”计划项目（2008AA06Z204）；国家自然科学基金项目（50974022）。

董浩（1987－），男，2009年大学毕业，硕士生，现主要从事微生物提高石油采收率方面的研究工作。

佘跃惠，Tel：13501070896；E－mail：sheyuehui＠163．com。