断血流皂苷的大孔吸附树脂纯化工艺研究

刘丽敏， 年四辉， 刘东平， 徐贵明

(1.安徽中医药高等专科学校，安徽芜湖 241001;2.皖南医学院，安徽芜湖 241002)

断血流为唇形科植物荫风轮Clinopodium polycephalum(Vaniot)C.Y.Wu et Hsuan或风轮菜Clinopodium chinensis(Benth.)O.Kuntze的干燥地上部分，具有止血之功，常用于崩漏、尿血、鼻衄、牙龈出血、创伤出血、子宫肌瘤等出血症的治疗［1］，化学成分主要包括皂苷、黄酮、氨基酸、多糖、酚性成分和挥发油等成分［2］，断血流总皂苷是其发挥止血作用的主要成分［3］。近年来大孔树脂被广泛应用于富集中药有效成分如皂苷、生物碱、黄酮类等成分［4-6］，大孔树脂应用于纯化断血流总皂苷的研究也有文献报道［7］，但在该研究中选择的树脂型号较少，总苷的纯度相对较低。为更好的指导皂苷纯化工艺，课题组在解决酶法水提取断血流皂苷的基础上［8］，采用静态吸附法考察11种树脂对断血流皂苷的吸附、解吸附作用及纯化效果，并结合动态吸附初步筛选出合适的大孔吸附树脂，为断血流皂苷的纯化工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 断血流(购于安徽省亳州中药材市场，经鉴定为荫风轮的地上部分);断血流皂苷A(中国药品生物制品检定所，批号110782-200301);大孔树脂D101、AB-8(安徽三星树脂有限公司)、D101-I、DM130、DM301、DA201、NKA-9(天津海光)、HPD100、HPD300、HPD450、HPD600(沧州宝恩化工);ZTC1+1澄清剂II型(北京正天成澄清技术有限公司);LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津);2550紫外可见分光光度计(日本岛津);KQ5200B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HY-5回旋振荡器(苏州威尔实验用品有限公司);提取用水为蒸馏水，色谱用水为乐百氏纯净水，甲醇为色谱纯，高氯酸为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 断血流提取液制备 称取断血流粗粉1 000 g，加入pH为7.0的水10 000 mL，60℃温度下加入5 U/g纤维素酶，酶解40 min后，微沸提取1 h，过滤，续加 10 000 mL水，微沸加热1 h［8］，合并两次提取液，加入ZTC1+1絮凝剂澄清，过滤，浓缩至5 000 mL，4℃冷藏备用。

1.2.2 大孔树脂的预处理［9］称取适量大孔树脂用无水乙醇浸泡24 h，使之充分膨胀后上柱，以95%乙醇洗至流出液与水混合不产生混浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇味，再以2倍柱体积的5%NaOH洗涤，蒸馏水洗至中性，续用2倍柱体积的5%HCl洗涤，蒸馏水洗至中性，备用。

1.2.3 标准曲线的制备

1.2.3.1 断血流皂苷A标准溶液的配制 精密称取于五氧化二磷中干燥至恒质量的断血流皂苷A 5.08 mg，甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，配制成0.203 mg/mL的溶液，备用。

1.2.3.2 断血流皂苷总苷标准曲线的制备［10］分别精密量取 1.2.3.1 项下溶液 50 μL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.6 mL于10 mL量瓶中，水浴蒸干，精密加入高氯酸5 mL，65℃水浴15 min，取出，冰水冷却至室温，分别加甲醇至刻度配制成 1.02、2.03、4.06、8.12、16.24、20.33、32.48 μg/mL的标准溶液，于320 nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，Y=0.022 7X+0.006 4，R2=0.999，断血流皂苷 A 在 4.06 ～32.48 μg/mL范围内线性关系良好。加样回收、重复性、精密度、稳定性试验均符合要求。

1.2.3.3 断血流皂苷A标准曲线的制备［11］色谱条件为Lichrospher C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，测定波长 250 nm，流动相为甲醇-水(80∶20)，体积流量为1 mL/min，柱温25 ℃，进样量为 10 μL。

分别精密量取1.2.3.1 项下溶液 0.1、0.5、1、2、4、8 mL至10 mL量瓶中，以甲醇定容至刻度，分别配制成2.03、10.16、20.33、40.66、81.31、162.62 μg/mL 的标准溶液，分别进样10 μL，250 nm波长测定，以积分面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程Y=11 778X+97.169，R2=0.999 8，断血流皂苷 A 在2.03 ～162.62 μg/mL范围内线性关系良好。加样回收、重复性、精密度、稳定性试验均符合要求。

1.3 树脂静态吸附与解吸 精密量取10 mL处理好的树脂，装入150 mL具塞锥形瓶中，加入120 mL断血流提取液，20℃的条件下恒温振荡10 h，吸附结束后，取1 mL以0.45 μm滤膜过滤，待用;树脂除去残留液后取80%乙醇60 mL分两次进行解吸附，每次0.5 h，合并解吸液，取1 mL以0.45 μm滤膜过滤，待用。各样品根据式(1)计算各树脂对断血流皂苷A的吸附量(Q);根据式(2)计算解吸率(D)。

式中:C1为断血流皂苷(断血流皂苷A)溶液起始质量浓度，C2为吸附结束后溶液中断血流皂苷(断血流皂苷A)质量浓度，Cd为解吸液中总皂苷(断血流皂苷A)的质量浓度，单位mg/mL;V0为吸附液体积，Vd为解吸液体积，单位mL;Ms为大孔树脂质量(除去水分后的干质量)，Mg为解析液真空干燥后固形物质量，单位g。

1.4 树脂动态吸附考察

1.4.1 比吸附量的考察 取1.2.2项下处理好的D101、D101-I、HPD300、DM301 树脂各30 mL，装柱，以2 BV/h 体积流量进行动态吸附，每10 mL分段收集流出液，至流出液中可以检测到总皂苷时停止上样，根据式(1)计算上述树脂比吸附量。

1.4.2 洗脱液体积分数及纯度考察 1.4.1项下各上样后树脂，取60 mL蒸馏水以2 BV/h体积流量洗去柱中水溶性杂质后，分别用 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇各60 mL以1 BV/h体积流量进行洗脱，分段收集，测定断血流皂苷A后水浴挥去乙醇，减压浓缩至干，称质量，根据式(3)计算纯度。

2 实验结果与分析

2.1 静态吸附结果 从表1可以看出，以总苷吸附量进行评价，DM130、HPD600、HPD450、HPD100、HPD300 型吸附树脂具有较大的吸附量，且吸附量与其比表面积有一定相关性，比表面积大，吸附量相对较大;吸附量与树脂的极性也有一定相关性，总体来看，极性小的的树脂具有较大的吸附量;以总皂苷解吸率进行评价，D101、D101-I、HPD300、AB-8、DM301具有相对高的解吸率。断血流皂苷A的吸附量相对较少，可能为断流皂苷A在药材中的含有量较少，若其达到饱和吸附，总皂苷的吸附率会较低。综合考虑总皂苷及断血流皂苷 A的吸附量、解析率，初步选择 D101、D101-I、HPD300、DM301做进一步动态考察。

表1 各厂家大孔树脂物理性能及对断血流总苷、断血流皂苷A吸附量、解吸率

2.2 动态比吸附量的考察 动态吸附量考察结果表明，以总皂苷计D101的吸附量为40.09 mg/g、D101-I的吸附量为46.85 mg/g、HPD300的吸附量为50.77 mg/g、DM301的吸附量为33.34 mg/g。相对于静态吸附量来说，动态吸附的量变小，并因动态吸附考虑到成分泄露问题一般不能达到饱和吸附。

2.3 洗脱体积分数及纯度考察 从图1、表2可以看出，洗脱剂体积分数对断血流皂苷A有一定选择性，主要集中在50%～80%乙醇洗脱部位，在该洗脱体积分数范围内断血流皂苷 A 分别解吸附 17.833 mg、11.418 mg、20.366 mg、19.885 mg，断血流皂苷 A的纯度分别为5.56%、1.93%、4.52%、3.85%，其中D101-I主要集中在70% ～80%洗脱部位，HPD300主要集中在60% ～80%洗脱部位，且断血流皂苷A在该部位的纯度较高。在40%以前体积分数乙醇洗脱部分UV法测定总皂苷的含有量较少或没有，采用HPLC法测定断血流皂苷A的含有量也较少或没有被洗脱，但此部分固形物质量较高，在具体工艺中可考虑上样后先用40%乙醇或者更高体积分数乙醇洗去杂质部分，然后用80%乙醇进行解吸附。

图1 4种树脂洗脱曲线

表2 采用不同体积分数乙醇洗脱后4种树脂洗脱物中断血流皂苷A纯度

2.4 验证性实验 结合2.3项下实验结果，分取上述4种树脂各30 mL装柱，分别取1.2.1项下溶液200 mL以2 BV/h体积流量上柱后，取60 mL蒸馏水以2 BV/h体积流量洗去柱中水溶性杂质，D101、HPD300两种树脂先用40%乙醇后用80%乙醇洗脱，D101-I、DM301两种树脂先用50%乙醇后用80%乙醇洗脱，洗脱剂的用量皆为60 mL，体积流量皆为1 BV/h，分段收集，测定断血流皂苷A后水浴挥去乙醇，减压浓缩至干，称质量，计算纯度。重复3次，断血流皂苷A的平均纯度 D101为 5.07%、D101-I为 5.63%、HPD300为4.74%、DM301为6.24%。4种树脂对断血流皂苷A的都具有一定的纯化效果，但应用D101、D101-I型树脂断血流皂苷A的解吸率偏低，应用HPD300型树脂断血流皂苷A纯度稍低，综合评价，DM301型树脂是合适的吸附树脂。

3 讨论与结论

断血流总皂苷是断血流药材及其制剂中的药效部位，断血流皂苷A是其质量控制指标，但断血流皂苷A在药材中的含有量较低，不到千分之一［12］。在指标选择中，我们选择总皂苷与断血流皂苷A两个评价指标，兼顾总有效部位及指标成分，在保证断血流总皂苷不损失的前提下尽可能的提高断血流皂苷A在提取物中含有量，并以此进行综合评价、筛选树脂。

目前市售的大孔吸附树脂型号较多，影响大孔吸附树脂吸附的因素也较多，树脂的极性、比表面积、孔径、生药质量浓度、吸附体积流量等因素都会影响到树脂的吸附量。本实验中以吸附量、解吸率、纯度为指标采用静态吸附结合动态吸附对产自3个厂家的11种不同极性的大孔吸附树脂进行考察，初步筛选出对断血流皂苷A选择性较好的DM301型树脂，吸附样品后的树脂分别以2 BV树脂体积的50%及80%乙醇以1 BV/h体积流量洗脱，80%洗脱部分断血流皂苷A的含有量可达到6.24%。然而，大孔树脂工艺富集药效成分的工艺较为复杂，仍需对选定的树脂做使用次数、再生条件等进一步考察。

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