芪黄明目胶囊对糖尿病小鼠视网膜病变及生长因子表达的影响

朱慧明，魏 刚，张会欣，何奇龙，高学东，齐晓琳，王宏涛

糖尿病性视网膜病变 (DR)是糖尿病微血管病变中最重要的表现，同时也是糖尿病并发症在眼部的主要表现［1］。研究表明，高糖状态下生长因子在眼内新生血管形成过程中起关键性作用，并且能够引起视网膜微血管渗透性的改变，造成视网膜屏障的破坏，同时能够诱导血管生成素生成增加，造成视力损坏。芪黄明目胶囊在DR临床研究中取得了很好的疗效［2］，但其机制尚不明确。故本研究以自发性2型糖尿病KK/Upj－Ay小鼠为模型，观察芪黄明目胶囊对DR小鼠视网膜生长因子表达的影响，探讨其机制，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 KK/Upj－Ay小鼠 (自发性2型糖尿病小鼠，用专用饲料喂养3个月即可造模成DR小鼠)36只，体质量30～40 g;C57BL/6小鼠9只，体质量25～30 g。均为SPF级，雄性，12周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号:0225144。饲养于SPF级动物屏障系统。

1.1.2 试剂与仪器 芪黄明目胶囊，由石家庄以岭药业股份有限公司提供;血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、色素上皮衍生因子 (PEDF)、转化生长因子－β(TGF－β)、胰岛素样生长因子－Ⅰ (IGF－Ⅰ)引物由上海生工生物技术公司合成;VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ一抗购自Santa Cruz公司。荧光定量 PCR仪，ABI公司产品;凝胶成像分析仪，Biorad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 36只KK/Upj－Ay小鼠按空腹血糖(FBG)水平随机分为模型组、芪黄明目胶囊高剂量组 (8.32 g生药/kg)、芪黄明目胶囊中剂量组 (4.16 g生药/kg)、芪黄明目胶囊低剂量组 (2.08 g生药/kg)，另设C57BL/6小鼠为对照组，每组9只。采用灌胃给药，芪黄明目胶囊各组按照相应的剂量给予芪黄明目胶囊，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，1次/d，连续3个月。

1.2.2 小鼠视网膜消化铺片标本制备 连续给药3个月后，把小鼠麻醉，取眼球，固定于10%甲醛液中48 h，分离视网膜，自来水漂洗，放入3%胰蛋白酶消化液37℃孵箱中消化振荡约3 h，仅剩下一层透明的视网膜血管网，进行HE－PAS染色。

1.2.3 Real Time PCR(qPCR)方法测定 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA的表达 取视网膜组织，常规方法提取RNA，进行Real Time PCR扩增，以GAPDH作为内参照。VEGF引物:上游:5'－TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC－3'，下游:5'－TGGAGTATTTCCGTGACCG －3'，产物片段150 bp;bFGF引物:上游:5'－CGTCAAACTACAACTCCAAGCA －3'，下游:5'－CGTCCATCTTCCTTCATAGCA －3'，产物片段 93 bp;PEDF引物:上游:5'－TGGGTAACCAAGTTTGACTCG －3'，下游:5'－AAGCCGTATCGTAAGATGGC－3'，产物片段116 bp;TGF－β引物:上游:5'－CCGCAACAACGCCATCTATG －3'，下游:5'－TGCTTCCCGAATGTCTGACG－3'，产物片段85 bp;IGF－Ⅰ引物:上游:5'－CTCTTCAGTTCGTGTGTGGAC－3'，下游:5'－AATGCTGGAGCCATAGCCT－3'，产物片段68 bp;GAPDH引物:上游:5'－TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC －3'，下游:5'－TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC－3'，产物片段143 bp。最终结果计为与对照组进行比较后的相对定量值，对照组设置为1。

1.2.4 Western blot法检测 VEGF、bFGF、PEDF、TGF － β、IGF－Ⅰ蛋白的表达 取视网膜组织，常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

1.3 统计学方法 计量资料以 (±s)表示，采用SPSS 11.5软件进行ANOVA统计分析和Dunnet t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜消化铺片形态学观察 对照组正常小鼠视网膜毛细血管分布规则，走向较直，管径粗细均匀一致;模型组小鼠视网膜毛细血管网排列紊乱，走向极不规则，多根毛细血管扭聚成丛，部分毛细血管扩张、管腔粗细不均;芪黄明目胶囊能明显改善上述变化，以芪黄明目胶囊高剂组最为明显。

2.2 视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA表达的变化 模型组小鼠视网膜 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表达与对照组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。与模型组比较，芪黄明目胶囊中、高剂量组小鼠VEGF、IGF－Ⅰ mRNA表达显著减少，芪黄明目胶囊高剂量组小鼠TGF－β mRNA表达显著减少，差异均有统计学意义 (P＜0.05);而芪黄明目胶囊低、中、高剂量组小鼠bFGF、PEDF mRNA表达与模型组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表1、图1)。

2.3 视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表达的变化 Western blot结果显示，模型组小鼠视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表达量与对照组比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。与模型组比较，芪黄明目胶囊中、高剂组小鼠视网膜VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表达量显著减少，差异均有统计学意义 (P＜0.05);而bFGF和PEDF蛋白表达量与模型组比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2、图2)。

表1 各组小鼠视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表达比较 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表1 各组小鼠视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表达比较 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:与对照组比较，*P＜0.05，△P＜0.01;与模型组比较，☆P＜0.05，★P＜0.01;VEGF=血管内皮生长因子，bFGF=碱性成纤维细胞生长因子，PEDF=色素上皮洐生因子，TGF－β=转化生长因子－β，IGF－Ⅰ=胰岛素样生长因子－Ⅰ

组别 只数 VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ对照组 3 1.05±0.15 1.51±0.44 1.14±0.16 0.90±0.14 1.54±0.47模型组 3 5.89±1.04△ 4.69±0.56△ 0.28±0.06△ 4.32±0.81△ 5.13±0.58△芪黄明目胶囊低剂组 3 4.23±0.83△ 4.79±1.11* 0.23±0.06△ 3.71±0.40△ 3.44±0.95*芪黄明目胶囊中剂组 3 2.48±0.43★ 5.41±1.49△ 0.29±0.09△ 2.86±0.71△ 2.50±0.85☆芪黄明目胶囊高剂组 3 2.54±0.64★ 4.06±1.23* 0.25±0.09△ 1.96±0.47☆ 2.36±0.78★F 0.000 0.014 0.000 0.000 0.002 21.638 5.459 49.154 17.837 10.065 P值值

表2 各组小鼠视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表达的比较 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表2 各组小鼠视网膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表达的比较 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:与对照组比较，*P＜0.05，△P＜0.01;与模型组比较，☆P＜0.05，★P＜0.01

组别 只数 VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ对照组 3 0.16±0.04 0.12±0.03 0.84±0.12 0.14±0.06 0.16±0.04模型组 3 0.79±0.12△ 0.61±0.08△ 0.34±0.05△ 0.71±0.11△ 0.69±0.11△芪黄明目胶囊低剂组 3 0.65±0.09△ 0.66±0.06△ 0.36±0.06△ 0.63±0.10△ 0.61±0.08△芪黄明目胶囊中剂组 3 0.48±0.07△★ 0.64±0.11△ 0.34±0.07△ 0.49±0.08△☆ 0.44±0.08△★芪黄明目胶囊高剂组 3 0.36±0.06＊★ 0.59±0.09△ 0.32±0.06△ 0.42±0.07△★ 0.33±0.05△★F 值0.000 0.014 0.000 0.000 0.000 27.593 25.447 26.652 20.485 23.251 P值

图1 各组荧光定量PCR扩增曲线Figure 1 Amplification curve of real－time fluorescent quantitative PCR of each groups

图2 各组小鼠视网膜Western blot结果Figure 2 Results of Western blot of each group

3 讨论

许多因素，如血糖、血压等对DR的发生发展均有重要作用［3］，其发病机制尽管尚未明确，但随着细胞生物学和分子生物学技术在DR发病机制方面的深入研究，已证实VEGF、bFGF、TGF－β、IGF－Ⅰ、PEDF等细胞因子通过一个复杂的网络系统共同参与了DR的发生发展。其中，正常情况下视网膜细胞可产生较低水平的VEGF，用以维持血管稳定性和视网膜正常发育，高血糖状态下视网膜局部缺氧导致VEGF表达上调，强力促进内皮细胞增殖，增加血管通透性及诱导新生血管生成，在DR的发生发展中起重要作用［4－5］。TGF－β眼内来源广泛，DR患者血清中TGF－β水平明显高于健康人群，并随病程的延长及眼部病情的加重而增高［6］，可能是促进内皮细胞的增生、黏附及细胞外基质的沉积、激活丝裂原活化蛋白激酶、增加纤维连接蛋白的合成而参与了DR的形成。IGF－Ⅰ是一种多功能细胞增生调控因子，是眼组织正常发育并完成其生理功能所必需的重要因子，但在糖尿病条件下，IGF网络系统的作用明显增强［7］，可以促进视网膜新生血管的形成。本研究结果显示，自发性2型糖尿病小鼠视网膜毛细血管网排列紊乱，走向极不规则，多根毛细血管扭聚成丛，部分毛细血管扩张、管腔粗细不均，提示6个月的KK/Upj－Ay小鼠发生了DR，采用qPCR和Western blot技术发现DR小鼠视网膜VEGF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA和蛋白表达量均显著升高，与文献报道一致［4－7］。芪黄明目胶囊治疗3个月后能明显改善视网膜损伤，延缓视网膜病变的发展，显著降低DR小鼠VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA和蛋白水平，提示芪黄明目胶囊治疗DR与下调VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表达有关。

同时本研究检测了DR小鼠bFGF和PEDF的表达。bFGF促进DR发展的具体机制尚不明确，目前认为bFGF可通过旁分泌途径和自分泌途径作用于视网膜的各层细胞，并促进其他生长因子的分泌，因而与DR密切相关［8］。PEDF被认为是最有效的天然血管抑制因子，在减少血管渗漏和新生血管形成等病理过程中发挥着重要作用，研究表明在DR的早、中、晚期PEDF的保护性作用持续存在［9］。本研究结果显示，模型组小鼠视网膜bFGF表达较正常小鼠显著升高，PEDF表达显著降低，芪黄明目胶囊各组bFGF、PEDF表达与模型组比较无显著差异，提示芪黄明目胶囊对DR的作用与bFGF、PEDF途径无关。

芪黄明目胶囊为中药复方制剂，以化瘀通络为前提，配合滋润通补、补气通络、熄风解痉、解毒通络诸法，从络论治DR的复方中药，在Ⅲ期临床试验中显示了很好的效果，同时还具有降糖的作用［2］。总之，芪黄明目胶囊对2型糖尿病小鼠视网膜发挥保护作用，可能与其下调 VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表达有关，但具体机制还需进一步深入研究。

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