高压氧对脑出血大鼠脑内HIF-1α表达和脑水肿的影响

王爱岳，李 强，周治平，许琼冠

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院神经内科，海南 海口 570208；2.海南省农垦总医院神经外科，海南 海口 570311)

脑水肿是脑出血后最主要的继发性病理生理改变，有效治疗脑水肿是减轻脑继发损害、保护和促进神经功能恢复的重要措施[1]。近年来国内外学者对高压氧(Hyperbaric oxygen，HBO)治疗脑出血进行了较为广泛的研究，并且证实HBO有明确的疗效，但对其作用的机制尚不清楚[2]。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子，任何氧浓度降低的条件下都可诱导细胞快速、大量的表达。我们既往的研究曾发现[3]，HIF-1α在脑出血后血肿周边脑组织中表达增加，并且其表达情况和脑水肿程度密切相关。但是在HBO作用下，血肿周边脑组织中HIF-1α的表达情况目前尚不明了。本实验拟对HBO作用后血肿周边脑组织中HIF-1α的表达变化进行研究，探讨HBO在治疗脑水肿、改善预后方面的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠88只，体重(250±30)g，雌雄不限，中南大学实验动物中心提供；鼠抗兔HIF-1α单克隆抗体购于加拿大Chemicon公司，二抗及DAB显色试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司。伊文思兰(Evane blue，EB)和甲酰胺购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 88只大鼠随机分为假手术对照组(sham组，8只)、脑出血组(ICH组)和脑出血+高压氧治疗组(HBO治疗组)(40只)。其中ICH组和HBO治疗组根据出血后时间又平均分为6 h组、24 h组、3 d组、7 d组和14 d组，每组8只。

1.2.2 脑出血动物模型制备 大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔内注射麻醉。固定大鼠头部于立体定向仪上，矢状切开头皮，暴露右侧顶骨，调节定向仪使前后囟处于同一水平面上，于冠状缝后4 mm、中线旁4 mm，牙钻钻一直径约1 mm的骨孔，硬膜保持完整。微量注射器抽取股静脉血50 μl，并将微量注射器固定于立体定向仪上沿骨孔垂直刺入脑组织3 mm，缓慢将自体血注入脑内，留针15 min后，缓慢拔出穿刺针，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。假手术组除不注射自体血外，余操作同上。动物麻醉苏醒后允许自由进食水。

1.2.3 高压氧处理 HBO治疗组大鼠置于DWCI50-300型透明动物实验舱内，纯氧洗舱5 min，升压5 min至0.1 MPa(2个大气压)后稳压，吸纯氧45 min，减压10 min。脑出血后3 h行高压氧治疗1次，24 h、3 d、7 d和14 d在每天同一时间行高压氧治疗1次。sham组和ICH组处于常压空气环境中不行高压氧处理。

1.2.4 标本制取 到相应时间点再次麻醉动物，动物断头后快速于冰盘上取出全脑，冠状切开脑组织，取血肿周边脑组织约2 mm×2 mm×2 mm，经4%的多聚甲醛固定后石蜡包埋，制成5 μm连续切片进行HE染色和HIF-1α免疫组化染色。另分别取血肿周边脑组织约100 mg进行脑组织含水量测定。

1.2.5 脑组织含水量测定 采用干/湿比重法进行脑组织含水量测定。将所取的脑组织以滤纸吸净其表面血液和脑脊液，分析天平快速称重后置之于105℃恒温烤箱内烘烤48 h，间隔12 h两次称重，重量变化小于0.2 mg时记录称量结果并取其平均值。以换算公式：脑组织含水量(%)=[(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重]×100%，计算脑组织含水量。

1.2.6 HIF-1α免疫组化染色步骤 ①切片常规脱蜡至水；②新鲜配制的3%H2O2，室温10 min灭活内源性酶；③微波修复抗原；④滴加封闭液20 min；⑤滴加HIF-1α单克隆抗体37℃反应1 h，4℃过夜；⑥生物素化山羊抗小鼠二抗37℃孵育20 min；⑦滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃反应20 min，DAB显色5 min；⑧苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.2.7 免疫组化结果判断 HIF-1α免疫组化结果阳性为细胞核染色，部分细胞浆染色。参照Remmele等的IRS(Immuno-reactive score)法进行计分，高倍镜下(×400)随机选取5个视野，以HIF-1α表达阳性细胞率和染色强度的计分之乘积进行判断。阳性细胞数所占的百分比为：未着色记为0分，1%～10%记为1分，11%～50%记为2分，51%～80%记为3分，81%～100%记为4分。阳性细胞着色强度分为：未着色记为0分，淡黄色记为1分，黄色记为2分，棕黄色记为3分。两计分相乘为最后结果。

2 结 果

2.1 HIF-1α在血肿周边脑组织中的表达情况 HIF-1α主要表达于神经细胞胞核，胞质中也有少量表达。sham组脑组织中HIF-1α蛋白呈阴性表达，ICH组和HBO治疗组均可见HIF-1α表达，与sham组比较，ICH组和HBO治疗组HIF-1α表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。HBO治疗组与ICH组大鼠脑组织中HIF-1α表达第14天时比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，其他时间比较，HIF-1α表达差异无统计学意义(P＞0.05)(见表1、图1、图2)。

图1 脑出血14 d HIF-1α在细胞核中的表达(SP法×400)

图2 高压氧治疗14 d HIF-1α在细胞核中的表达(SP法×400)

2.2 脑出血后脑组织含水量变化的比较 脑出血3 d内，脑组织含水量进行性增加且于出血后3 d达到高峰，此后脑组织含水量逐渐下降。与Sham组相比，ICH组和HBO治疗组在出血后各时间点脑组织含水量明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。HBO治疗组与ICH组大鼠脑组织含水量第14天时比较差异有统计学意义(P＜0.05)，其他时间相比较，脑组织含水量差异无统计学意义(P＞0.05)(见表1)。

表1 脑出血后不同时间观测指标结果比较(±s，n=8)

表1 脑出血后不同时间观测指标结果比较(±s，n=8)

注：与sham组脑组织比较，*P＜0.05，与ICH组同时间比较，ΔP＜0.05。

组别 脑出血时间 观测指标脑组织含水量(%)HIF-1α表达IRS评分6 h 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d 6 h 24 h 3 d 7 d 14 d sham组ICH组HBO组77.63±0.68 78.97±1.43*79.86±1.06*80.59±1.14*79.30±1.36*78.39±1.12*77.68±0.91*79.52±1.67*79.91±1.76*79.72±1.74*77.08±1.18Δ 0.00±0.00 3.25±1.58*6.87±3.09*8.62±2.72*7.25±2.37*4.37±2.13*3.37±1.41*4.87±1.64*7.25±2.76*5.12±2.59*2.25±1.58Δ

2.3 HIF-1α蛋白表达与脑水肿的相关性 相关分析显示，ICH组HIF-1α蛋白表达与脑水肿的程度成正相关，r=0.446，P＜0.05；HBO治疗组HIF-1α蛋白表达与脑水肿的程度无相关性，r=0.319，P＞0.05。

3 讨 论

HIF-1是普遍存在于人和哺乳动物细胞内的缺氧应答调控因子，在调节缺氧诱导的基因表达中发挥重要作用。HIF-1是由α和β大小两个亚基组成的核转录因子，其中α亚基为HIF-1所特有，是其主要功能单位，HIF-1的量和活性主要由HIF-1α决定[4]。HIF-1α在常氧状态下不稳定，半衰期不到5 min，合成后迅速被泛素化，继而由蛋白酶溶解[5]。而在缺氧状态下，HIF-1α在胞浆内合成增加，半衰期明显延长，从而对其下游基因，如：VEGF、MMPs、Glu-1、bax/bcl-2等基因进行调控。目前认为，HIF-1α与神经细胞在缺氧状态下抗损伤机制的产生有密切关系[6]。

我们在实验发现，HIF-1α蛋白在脑血肿周边神经细胞中有明显的表达，其原因可能与脑出血后应激反应所致的脑血管收缩和血肿压迫致使血肿周边脑组织中存在不同程度的缺血、缺氧有关。而随着血肿压迫时间的延长，部分缺血脑组织发生缺血后再灌注，使得HIF-1α蛋白表达进一步增加。这表明：HIF-1α的表达与神经细胞缺血、缺氧的时间密切相关[7]。我们在研究中也发现，脑出血后HIF-1α蛋白的表达和脑水肿的变化呈现一致性，相关分析显示：出血后HIF-1α蛋白表达与脑水肿的程度成正相关关系(r=0.446，P＜0.05)，这就表明，HIF-1α蛋白参与了出血后脑组织水肿的形成。如能抑制HIF-1α的表达，将会有效减轻出血后脑水肿的程度。

已有研究表明，在一定的压力和时间范围内，高压氧对缺血和水肿的脑组织存在保护作用[8]。我们在实验中发现，脑出血后经过高压氧治疗，脑组织中HIF-1α表达程度及脑水肿程度都有明显降低，说明高压氧能有效减少HIF-1α表达并减轻脑组织水肿程度。但令人感兴趣的是，ICH组HIF-1α表达与脑水肿的程度成正相关(P＜0.01)，而HBO治疗组HIF-1α表达与脑水肿的程度则无相关性(P＞0.05)，这表明高压氧治疗脑水肿过程中可能存在多种途径和机制，抑制HIF-1α表达仅是其中一种途径。而有研究显示[9]，高压氧可通过抑制水通道蛋白4(AQP4)的表达，减轻脑组织的水肿程度。此外我们还发现：在6 h、24 h、3 d、7 d HBO治疗组血肿周边脑组织中HIF-1α表达程度和脑水肿程度与对应时间点不经高压氧治疗的ICH组比较差异无统计学意义，而在第14天时差异有统计学意义，这表明高压氧治疗的效果存在滞后性，早期和每日多次高压氧处理可能更为有效降低脑组织水肿程度。

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