牛奶和婴儿配方奶粉中三聚氰胺筛选和定量方法—— ELISA，HPLC-UV，GC-MS和LC-MS/MS的验证和测定效果（三）

文 / 季昀 庞学燕 译

（江苏扬州大学动物科学与技术学院）

▲接本刊2012年第8期

图1 MBPIF的UV色谱图（240 nm，奶粉蛋白质含量> 15%）

3.1.2 HPLC-UV法工作特性

学者们提出了几种用HPLC-UV定量测定三聚氰胺的方法（Ishiwata，Inoue，Yamazaki，et al，1987；Kim，et al，2008；Muñiz Valencia，et al.，2008）。首先，使用三氯乙酸（TCA）－乙腈溶液沉淀蛋白质，接着用强离子交换（SCX-SPE）柱进行清洗，然后，洗脱液用C18 RP柱，通过离子对HPLC进行分离。所选的色谱条件可使三聚氰胺从包含有CM和MBPIF的有机成分中分离出来（图1）。除了用保留时间确定外，在200 nm到400 nm之间记录三聚氰胺光谱特性也可用来确定所选峰的特性。

三聚氰胺紫外光谱的吸收谱带大约在240 nm处（图2），这些吸收谱带是三聚氰胺的标志。但是，如果色谱层析进行的条件和样本处理得不够小心，干扰物质可能会使三聚氰胺的定量出现错误。尤其是像婴儿配方奶粉这样含有复杂蛋白质水解形式的低敏感度样本用这种方法会受到干扰，因为通过沉淀法或固相萃取没有将肽彻底去除，所以会导致三聚氰胺含量的明显高估。因此，波长范围至少在200～270 nm的紫外光谱的记录结果需要与三聚氰胺标准品的光谱记录结果进行比对。另外，样本中蛋白质的含量对沉淀效果影响很大，研究发现，被测样本的量的多少必须根据它的蛋白质含量进行调整。为了确保有效的沉淀和好的分离效果，待测样本最佳蛋白含量应在0.3～0.4 g。

对于CM，HPLC-UV方法可以检测三聚氰胺从0.05 mg/kg到2.50 mg/kg的动态线性变化，对于蛋白质质量分数小于15%的MBPIF，检测范围在0.13 mg/kg到6.25 mg/kg之间，而对于蛋白质质量分数≥15%的MBPIF，检测范围在0.25 mg/kg到12.50 mg/kg。CM以0.03 mg/kg（0.09 mg/kg）测定LOD 和LOQ，而蛋白质含量小于15%的MBPIF为0.06 mg/kg（0.18 mg/kg），蛋白质含量≥15%的MBPIF为0.12 mg/kg（0.36mg/kg），LOD和LOQ信噪比分别为3和10。本试验对含3 个不同浓度水平的三聚氰胺的CM和MBPIF测定了重复率和批间精密度和回收率，这些工作特性总结于表4（见2012年第8期）。

作为半定量测定CM和MBPIF中三聚氰胺残留的可靠方法，ELISA和HPLC-UV法都能够满足指定的范围要求（世界卫生组织和不同国家最常见的对于婴儿配方食品中的三聚氰胺限制量为1 mg/kg，对于其它牛奶和以牛奶为原料的食品或其它食品为2.5 mg/kg）。就样本的快速筛选来讲，分析时间和相对简单的仪器设备及数据处理是理想的，但是，对于三嗪杀虫剂环丙氨嗪等ELISA具有特异性交叉反应性的样本来说，这些分析技术是受限制的。UV和二极管阵列检测（DAD）对于HPLC分离的样本具有更低的选择度，因为很多有机物的吸收波长在200～270 nm之间（Ehling，Tefera& Ho，2007； Patakioutas，et al，2007），因此，推荐二者用于筛选。

图2 用DISCOVERY C18柱于240 nm下分离的三聚氰胺标准品溶液（0.4 μg/mL）

图3 1.5 ng/mL三聚氰胺标准溶液（上）和，-三聚氰胺标准溶液（下）GC-MS全扫描色谱图

3.2 鉴定方法

GC-MS对被测物的分离效果较好，因为其是根据分子量选择靶分子，并鉴定其特征的。使用稳定的同位素标记三聚氰胺内标和单离子监测模式定量测定实现了精确定量。在评价方法中，串联质谱法（MS/MS）提供了高度的分离性，它根据靶分子的分子量选择靶分子，通过使用多重反应监测已知的碎片离子量来鉴定特性。应用稳定同位素标记内标的同位素稀释法表明该方法对不同样本基质效应可以进行补偿（Smoker，Krynitsky，2008）。前人研究证实了，在宠物食品（Dobson，et al，2008；Varelis，Jeskelis，2008）和CM以及MBPIF中（Desmarchelier，et al，2009）能够运用稳定同位素稀释LC-MS/MS 技术定量测定三聚氰胺和三聚氰酸。

图4 添加0.025 mg/kg 三聚氰胺的MBPIF样本萃取SIM色谱图

3.3 GC-MS法工作特性

按照之前描述的分析程序，包括用乙腈沉淀蛋白质，然后用强离子交换固相萃取（SCX-SPE）清洗，再衍生。进一步通过GC-MS分析三甲基硅烷基衍生物，在选择性离子监测模式（SIM）下进行定量，如果需要进一步鉴定标准，则需要在全扫描（FS）模式下进行。选择用于定量和鉴定的离子见表1（见2012年第4期）。图3显示了三聚氰胺标准溶液及其内标的全扫描色谱图和质谱。3个三聚氰胺碎片和2 个标记的标准品碎片的单离子检测色谱图见图4。这种方法使三聚氰胺能够明确地被鉴定出来。由于同位素稀释法的可靠性，校正和测试样本只需相同的内标物溶液即可。这种方法只受到未标记三聚氰胺标准品的不准确前处理和被测部分权重的精密度不足的影响。

图3显示了已萃取的2 种主要的离子和标记三聚氰胺的差减质谱。3种主要的离子的萃取用于三聚氰胺，2种用于标记的三聚氰胺。图4分别为差减质谱图。

三聚氰胺离子质荷比为m/z 171、327和342，而被标记的三聚氰胺产生的质荷比为m/z 333和m/z 348。以批间精密度（iR）为基础获得的6 个不同的外标曲线来测试线性度。MBPIF中线性度超过了三聚氰胺的0～0.500 mg/kg 的范围。校正曲线为线性模型，残留物均匀分布，且响应系数稳定在考虑的浓度范围内。根据批间精密度来验证数据，按照所描述的GC-MS法测定的LOD （0.025、0.050和0.075 mg/kg 每个6 个重复），根据2002/657/EC 采用的5%的β型错误于0.019 mg/kg 进行鉴定的批间精密度来验证数据（0.025、0.050和0.075 mg/kg每个6 个重复），根据2002/657/EC 采用的1%的α型错误并于0.009 mg/kg 来鉴定进行计算。对MBPIF中4 个不同浓度水平的三聚氰胺测定了重复性和批间精密度范围和回收率。这些工作特性总结于表4（见2012年第8期）。

（未完待续）