一氧化氮在乙醇后处理心肌保护中的作用*

高 琴,胡俊锋,于 影,姜翠荣,关宿东,李正红△

(1.蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠 233030;2.蚌埠医学院第一附属医院呼吸内科,安徽 蚌埠 233004)

近年来,一定浓度的乙醇可发挥心肌保护作用已越来越得到共识。临床数据显示,适度饮酒可降低心肌梗死的发生和心肌梗死患者的致死率,减少中风的发生[1]。乙醇心肌保护作用机制涉及腺苷受体、肾上腺素受体和蛋白激酶C系统的激活、线粒体ATP敏感性钾通道的开放、热休克蛋白的表达、激活JNK-1、c-Jun等信号转导发挥抗凋亡作用、促进乙醛脱氢酶2的生成等[2～4]。一氧化氮(nitric ox-ide,NO)是机体内重要的信号转导分子,乙醇的保护作用是否与改变心肌组织NO的释放有关报道甚少。本研究拟在乙醇后处理心肌保护作用的基础上,研究其是否通过改变心肌组织NO发挥作用,进一步分析其与细胞凋亡之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物和药品

健康雄性SD大鼠体重200～250 g,清洁级,由蚌埠医学院实验动物中心提供。

左旋-硝基精氨酸甲基酯(L-nitro-argininemethylester,L-NAME),苍术苷(atractyloside,Atr),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5 triphenyl-tetrazolium chloride,TTC),伊文思兰(Evans blue)为Sigma公司产品。99.7%乙醇(ethanol,EtOH)购自安徽省蚌埠市新科电化试剂厂。NO试剂盒购自南京建成生物制品有限公司。Bcl-2、Bax和β-actin引物均由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下Bcl-2上游引物为5'-CTG GTG GAC AAC ATC GCT CTG-3',下游引物为5'-GGT CTG CTG ACC TCA CTT GTG-3',产物长度228 bp;Bax上游引物为5'-GGA TCG AGC AGA GAG GAT GG-3',下游引物为5'-TGG TGA GTG AGG CAG TGA GG-3',产物长度 464 bp;β-actin 上游引物为5'-GAT GGT GGG TAT GGG TCA GAAGGA C-3',下游引物为5'-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CT-3',产物长度630 bp。改良Krebs-Henseleit(K-H)液成分(mmol/L):NaCl 118.0,KCl 4.7,K2PO41.2,MgSO41.2,NaHCO325.0,CaCl21.25,葡萄糖11.0,pH 7.3～7.4。

1.2 大鼠离体心脏灌流

雄性SD大鼠断头后开胸,迅速取出心脏,置于4℃改良K-H液中冲洗,固定于Langendorff灌流装置,K-H液常规恒压(76 mmHg)灌流,pH 7.3～7.4,以95%O2+5%CO2饱和,维持灌流液温度37℃。将充水乳胶囊由切开的左心耳处插入至左心室,囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器,MedLab生物信号采集处理系统记录血流动力学变化。

1.3 左心室功能评价

向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)维持于4～8 mmHg,连续记录左心室发展压(left ventricular developed pressure,LVDP)、心率(heart rate,HR)、左心室内压最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure,±dP/dtmax)和LVEDP等各项指标。

1.4 灌流心脏流出液乳酸脱氢酶的测定

在心肌复灌5 min和10 min收集冠脉流出液,分光光度法测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量。

1.5 心肌梗死面积测定

离体心脏复灌结束后再结扎冠脉,取1%伊文思兰经主动脉注入心脏,冷冻后与心脏纵轴垂直切成2 mm均匀薄片,1%TTC染色10～15 min,10%福尔马林固定,区分各区域。蓝色为非梗死区,红色为危险区,苍白色为梗死区。扫描仪扫描染色的心脏切片。使用Image/J软件测量相关区域面积,计算梗死区占危险区的比值。

1.6 心肌组织NO的测定

取左心室心尖部组织100 mg,匀浆后离心,取上清液,采用硝酸还原比色法测定心肌组织中NO含量。

1.7 RT-PCR方法检测Bcl-2和Bax mRNA表达

提取心尖部组织总RNA,用随机引物逆转录合成cDNA进行PCR扩增。扩增条件:95℃预变性3 min后,以(1)95℃50 s变性;(2)Bcl-2退火温度57.6℃45 s,Bax退火温度 62.2℃45 s,β-actin退火温度55.5℃45 s;(3)72℃60 s,反应30个循环。将PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭显色。GIS凝胶图像处理系统拍摄记录,图像分析软件对泳带进行光密度扫描作半定量分析,以目的基因与内参对照的积分吸光度比值(Bcl-2/β-actin;Bax/βactin)表示mRNA相对表达量,并计算Bcl-2/Bax比值。

1.8 实验分组

大鼠心跳稳定20 min后,随机分为5组(n=8):(1)正常对照组:心肌K-H液持续灌流150 min;(2)缺血/复灌组:结扎冠状动脉左前降支30 min模拟局部心肌缺血,随后松开结扎线恢复灌流120 min为单纯缺血/复灌(ischemia and reperfusion,I/R);(3)乙醇后处理组:结扎冠状动脉左前降支30 min,恢复灌流120 min复制I/R,但在缺血末5 min,复灌初期10 min给予乙醇50 mmol/L,共灌流15 min[4]进行乙醇后处理干预;(4)乙醇后处理+L-NAME组:同乙醇后处理组,但在缺血末5 min复灌初期10 min同时给予一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(100 μ mol/L)灌流15 min[5];(5)乙醇后处理+Atr组:同乙醇后处理组,但在缺血末5 min复灌初期10 min同时给予线粒体渗透性转换孔道开放剂Atr(20 μ mol/L)灌流15 min[6]。

1.9 统计分析

2 结果

2.1 血流动力学及酶学、梗死面积改变

随着灌流时间的延长,正常对照组大鼠LVDP和±dP/dtmax略有下降,LVEDP略有上升,但前后比较无统计学意义。与正常组相比,I/R组缺血及复灌各时间点LVDP和±dP/dtmax明显下降,LVEDP显著抬高,LDH释放增多(P＜0.01)。与I/R相比,乙醇后处理使LVDP和±dP/dtmax明显上升,LVEDP下降(表1),心肌梗死面积降低(P＜0.01),复灌 5 min和10 min冠脉流出液中LDH含量明显降低(P＜0.01,表2)。与乙醇后处理组相比,一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和线粒体渗透性转换孔道开放剂Atr引起复灌期LVDP和±dP/dtmax下降,LVEDP抬高,心肌梗死面积增大,LDH释放增多(表1,表2)。

2.2 心肌组织NO含量改变

与正常大鼠心肌相比,I/R大鼠心尖部组织NO含量明显增加。与I/R相比,乙醇后处理使NO含量明显降低。L-NAME和Atr与乙醇联合用药,均使得NO进一步下降(表3)。

2.3 心肌组织Bcl-2和Bax变化

与正常组相比,I/R组心肌Bax mRNA表达增加,Bcl-2/Bax比值降低。与I/R组相比,乙醇后处理组Bcl-2 mRNA表达增强,Bax mRNA表达降低,Bcl-2/Bax比值显著增加。L-NAME和Atr与乙醇联合用药,均使Bcl-2 mRNA的表达降低,Bax mRNA的表达提高,Bcl-2/Bax比值降低(图1,表4)。

3 讨论

NO作为调节心血管系统的主要细胞信使分子在机体生理和病理过程中发挥着重要的作用。本实验中观察到心肌I/R后NO含量明显增加,Bcl-2/Bax比值降低,心肌出现损伤和凋亡发生;EtOH使NO在一定范围内降低,心功能得到改善,减弱凋亡的发生;L-NAME和Atr进一步降低NO水平,Bcl-2/Bax比值亦降低,减弱了EtOH的心肌保护作用和抗凋亡作用,提示机体内NO维持一定水平是保持正常生理功能的必要条件,NO浓度过高或过低都可能造成机体损伤。EtOH可能通过降低心肌I/R引起的NO过度增加发挥保护作用。

Tab.1 Hemodynamic parameters in the isolated perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(±s,n=8)

Tab.1 Hemodynamic parameters in the isolated perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs I/R group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs EtOH group

Variable Baseline Ischemia 30 min Reperfusion 30 min Reperfusion 120 min LVDP(mmHg)Normal 83.52±5.82 81.44±6.23 80.61±6.65 78.95±5.91 I/R 84.24±6.78 47.22±7.22** 48.11±9.94** 36.16±5.77**EtOH 84.66±7.54 48.61±10.25 69.74±6.24## 63.16±6.13##EtOH+L-NAME 83.70±5.92 49.47±9.57 43.08±6.65△△ 39.61±6.25△△EtOH+Atr 84.26±5.51 46.20±7.03 49.80±4.68△△ 38.01±7.05△△LVEDP(mmHg)Normal 6.12±1.54 6.54±1.42 6.94±2.01 7.13±2.33 I/R 5.94±1.37 8.38±1.68** 10.44±2.59** 12.36±1.91**EtOH 5.84±1.01 7.18±3.05 7.63±1.26# 7.95±0.78##EtOH+L-NAME 6.03±1.26 8.36±0.46 12.74±2.23△△ 12.84±3.67△EtOH+Atr 5.96±1.07 8.12±1.03 11.38±2.57△ 12.91±3.04△+dp/dtmax(mmHg/s)Normal 2354.21±209.44 2322.47±202.25 2215.28±177.65 2142.21±190.41 I/R 2313.21±247.25 1566.94±198.05** 1204.53±155.27** 970.89±134.76**EtOH 2466.59±353.51 1560.63±317.11 1505.52±169.15# 1463.66±189.22##EtOH+L-NAME 2240.25±359.06 1571.42±329.95 1207.43±215.62△ 928.07±132.69△△EtOH+Atr 2242.55±418.47 1576.45±306.91 1220.73±175.19△ 947.25±130.73△△-dp/dtmax(mmHg/s)Normal 1562.07±145.78 1506.41±160.09 1478.93±152.66 1452.35±133.48 I/R 1585.48±169.96 986.79±194.1** 626.65±130.87** 562.93±117.12**EtOH 1519.66±279.89 984.58±206.16 897.90±149.12# 853.88±150.25##EtOH+L-NAME 1506.82±182.92 935.33±175.39 628.45±120.52△△ 565.24±107.28△△EtOH+Atr 1538.10±139.09 899.95±151.22 624.62±172.34△ 559.65±113.81△△

Tab.2 Infarct size and LDH release in coronary effluent of rat hearts(±s,n=8)

Tab.2 Infarct size and LDH release in coronary effluent of rat hearts(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;## P＜0.01 vs I/R group;△△ P＜0.01 vs EtOH group

Group Infarct size(%)LDH(U/ml)at reperfusion 5 min 10 min Nor mal 0±0 19.52±3.55 20.25±3.63 I/R 49.42±4.96 65.06±5.24**72.43±4.65**EtOH 29.59±2.37##19.37±3.31##31.06±5.20##EtOH+L-NAME48.95±7.55△△ 56.50±6.18△△ 58.35±4.24△△EtOH+Atr 50.47±5.32△△ 62.56±3.83△△ 65.73±4.98△△

Tab.3 NO contents of heart tissue in rats(±s,n=8)

Tab.3 NO contents of heart tissue in rats(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:atractyloside**P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs I/R group;△P＜0.05,△△P＜0.01 vs EtOH group

Group NO content(μ mol/L)Normal 38.03±2.16 I/R 80.55±2.28**EtOH 25.21±5.06**##EtOH+L-NAME 18.47±3.67##△EtOH+Atr 18.68±4.43##△△

Fig.1 Changes of Bcl-2 and Bax mR NA expressions of heart tissue in rats

Tab.4 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of heart tissue in rats(±s,n=8)

Tab.4 Expressions of Bcl-2 and Bax mRNA of heart tissue in rats(±s,n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion;EtOH:Ethanol;L-NAME:L-nitro-arginine-methylester;Atr:Atractyloside**P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs I/R group;△△P ＜0.01 vs EtOH group

Group Bcl-2/β-actin Bax/β-actin Bcl-2/Bax Normal 0.33±0.05 0.70±0.08 0.47±0.04 I/R 0.26±0.03 1.42±0.06**0.18±0.03**EtOH 0.42±0.06##0.78±0.07##0.53±0.05##EtOH+L-NAME0.31±0.03△△ 1.09±0.06△△ 0.29±0.07△△EtOH+Atr 0.24±0.02△△ 1.26±0.07△△ 0.19±0.04△△

NO生成过多引起心肌功能受损。心肌I/R时产生大量ROS,尤其是超氧阴离子(O2-)等“爆发式”生成。过多的NO可与O2-反应,生成具有很强细胞毒性的过氧亚硝酸阴离子(ONOO-),氧化细胞内铁/硫中心、锌指结构、蛋白巯基(如Na+-Ca2+交换蛋白)、脂质等,抑制线粒体呼吸,影响ATP的产生,引起钙超载,导致蛋白质、脂质和DNA的损伤及凋亡发生[7]。本实验结果显示EtOH可使NO释放明显降低,Bcl-2/Bax比值增加,提示EtOH可能通过降低NO的生成,减少ONOO-等的过度增加发挥抗缺血复灌损伤和抗凋亡作用。

实验中,我们还观察到一氧化氮合酶抑制剂LNAME和线粒体渗透性转换孔道开放剂Atr减弱E-tOH保护作用的同时,NO水平进一步降低,提示NO浓度过低对机体亦不利。一定浓度的NO是维持心血管正常功能活动的必需条件。一定剂量的NO引起冠脉扩张,冠状血流增加;NO可直接淬灭氧自由基、阻滞羟自由基的形成及终止脂膜上的自由基链式反应,维持内皮细胞的完整性;NO减少中性粒细胞的粘附,减少再灌注晚期心肌组织内中性粒细胞的浸润;NO还可直接作用于线粒体ATP敏感性钾通道等,引起其开放,减轻Ca2+超载等起到心肌保护作用[8]。L-NAME在EtOH降低NO的基础上使其水平进一步下降,可能使得NO低于了机体的正常需求,从而减弱EtOH的作用。Atr是线粒体渗透性转换孔道的开放剂,其开放亦引起NO的过度降低。文献报道NO可能通过下调线粒体跨膜电位、开放线粒体膜通透性转换孔并释放线粒体 cytC,诱导SMMC-7721和HepG2细胞凋亡[9];亦有文献报道NO可抑制该孔道的开放[10],进一步提示NO和该孔道之间存在一定的联系,两者之间如何相互影响?其机制还有待进一步探讨。

因此我们推测,EtOH后处理可通过降低心肌NO释放和抑制线粒体渗透性转换孔道的开放发挥心肌保护作用。

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