RP-HPLC法测定银天颗粒中主要药效成分的含量Δ

张 辉，李金玲，王永胜，张聪聪，徐晓玉（西南大学药学院/重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆400715）

银天颗粒是本课题组研制的中药复方保健品，主要用于防治春夏之交瘟疫流行、热毒所伤；或夏季伤暑、烦热口渴；或嗜食香燥、火毒内生等。它是本课题组科技扶贫项目“秀山金银花产业开发”的产业链深加工产品，是从秀山灰毡毛忍冬（山银花）、栀子等物质中提取的有效成分制成的一种药食两用保健品，已经申报国家技术发明专利，具有自主知识产权。其中，山银花主要功效成分为绿原酸，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆等药理作用[1，2]。栀子的主要功效成分为栀子苷，具有抗炎利胆、抗肿瘤、降血糖等多种药理作用[3，4]。为了更好地控制银天颗粒的质量，本试验采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对其主要药效成分绿原酸和栀子苷进行了含量测定。

1 仪器与试药

1200Series型HPLC仪（美国Agilent公司）；EL-2046型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

绿原酸、栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413、110749-200714）；银天颗粒（西南大学中药研究所研制，规格：2g/袋，批号：2010092801、2010092802、2010092803）；乙腈、磷酸为色谱纯，甲醇为分析纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 RP-HPLC法测定银天颗粒中绿原酸的含量

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Platisil-ODS（250mm×4.6mm，5µm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸（20∶80）；流速：1.0mL·min－1；检测波长：326nm；柱温：25℃；进样量：20µL。

2.1.2 对照品贮备液的制备 精密称取绿原酸对照品0.0108g，置于100mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为108.0µg·mL－1的对照品贮备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取银天颗粒适量，研成细粉，取0.3g，精密称定，置25mL棕色容量瓶中，加50%甲醇20mL，超声处理（工作频率：40kHz，功率：220W）30min，放冷至室温，加50%甲醇定容，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL，置5mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀。用0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方量制备仅含辅料的颗粒作为阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样检测。结果表明，阴性对照对绿原酸的测定无干扰；绿原酸的保留时间为5.5min，峰形良好，与其他组分峰分离较好；理论板数不低于5000，分离度均＞4。色谱见图1。

图1 绿原酸的HPLC图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.绿原酸Fig 1 HPLC chromatograms of chlorogenic acidA.substance control；B.test samples；C.negative control；1.chlorogenic acid

2.1.6 标准曲线的制备 分别精密吸取绿原酸对照品贮备液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，置10mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，用0.22µm微孔滤膜过滤后按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积。以绿原酸浓度（c，µg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝11.022c－5.5739（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，绿原酸检测浓度在5.4～108.0µg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.1.7 精密度试验 取绿原酸对照品溶液（21.6µg·mL－1）适量，连续进样测定6次，记录峰面积。结果，RSD＝0.15%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、24h按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝1.79%（n＝6），表明供试品溶液在24h内稳定。

2.1.9 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：2010092803）适量，共6份，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定绿原酸的含量。结果，6份样品中绿原酸的平均含量为11.08mg·g－1，RSD＝0.16%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批次样品（批号：2010092803，绿原酸含量：11.08mg·g－1）适量，共6份，分别精密加入适量的绿原酸对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。结果，绿原酸的平均回收率为99.04%，RSD＝2.66%（n＝6）。

2.1.11 样品含量测定 按上述方法测定3批样品（批号：2010092801、2010092802、2010092803）含量，各平行操作 3份。结果，3批样品中绿原酸的平均含量分别为11.32、11.81、11.08mg·g－1（n＝3）。

2.2 RP-HPLC法测定银天颗粒中栀子苷的含量

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（10∶90）；检测波长：238nm；流速：1.0mL·min－1；柱温：25℃；进样量：20µL。

2.2.2 对照品贮备液的制备 精密称取栀子苷对照品0.0110g，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为110µg·mL－1的对照品贮备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取银天颗粒适量，研成细粉，取3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，摇匀，称重，超声处理（工作频率：40kHz，功率：220W）30min，放冷至室温，再称重，加甲醇补足失重，密塞，摇匀。用0.22µm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方量制备仅含辅料的颗粒作为阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2.5 系统适用性试验 分别吸取供试品、对照品和阴性对照溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样检测。结果表明，阴性对照对栀子苷的测定无干扰；栀子苷的保留时间为19.2min，峰形良好，与其他组分峰分离较好；理论板数不低于4000，分离度均＞4。色谱见图2。

图2 栀子苷的HPLC图A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.栀子苷Fig 2HPLC chromatograms of gasminoidinA.standard sample；B.test samples；C.negative control；1.gasminoidin

2.2.6 标准曲线的制备 分别精密吸取栀子苷对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，置10mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，用0.22µm微孔滤膜滤过后按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积。以栀子苷浓度（c，µg·mL－1）为横坐标，峰面积积分值（A）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝25.583c+4.8044（r＝0.9999，n＝6）。结果表明，栀子苷的检测浓度在11～110µg·mL－1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2.7 精密度试验 取栀子苷对照品溶液（55µg·mL－1）适量，连续进样测定6次，记录峰面积。结果，RSD＝0.45%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别于0、0.5、2、4、8、12h按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝2.06%（n＝6），表明供试品溶液在12h内稳定。

2.2.9 重复性试验 精密称取同一批样品（批号：2011092802）适量，共6份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样，测定栀子苷的含量。结果，6份样品中栀子苷的平均含量为0.168mg·g－1，RSD＝0.82%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批次样品（批号：2011092803，栀子苷含量：0.178mg·g－1）适量，共6份，分别精密加入适量的栀子苷对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。结果，栀子苷的平均回收率为97.69%，RSD＝2.07%（n＝6）。

2.2.11 样品含量测定 按上述方法测定3批样品（批号：2010092801、2010092802、2010092803）含量，各平行操作3份。结果，栀子苷的平均含量分别为0.147、0.168、0.178mg·g－1。

3 讨论

为了控制银天颗粒中山银花和栀子的含量，笔者参照药典及相关文献[5～8]，分别建立了银天颗粒中绿原酸、栀子苷含量测定的RP-HPLC法。结果表明，在本试验所选的色谱条件下，银天颗粒中药用辅料对绿原酸、栀子苷的含量测定无干扰，目标成分峰形良好，且能与其他组分峰较好地分离。2种方法均具有回收率高、重复性好、分析快速、结果准确、专属性强的优点，可用于银天颗粒的质量控制。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：28.

[2] 王 辉，田呈瑞，马守磊，等.绿原酸的研究进展[J].食品工业科技，2009，30（5）：341.

[3] 倪慧艳，张俊慧，傅海珍.中药栀子的研究与开发概述[J].中国中药杂志，2006，31（7）：538.

[4] 李葆华.栀子的研究概况[J].时珍国医国药，2004，33（5）：583.

[5] 徐 玲，张继芬，吴芳洲，等.HPLC法测定双花颗粒中绿原酸的含量[J].中国药房，2011，22（23）：2156.

[6] 陈 辉.HPLC法测定复方感冒颗粒中绿原酸的含量[J].中国中药杂志，2008，33（5）：583.

[7] 孙文武.HPLC法测定栀柏合剂中栀子苷的含量[J].中国药房，2007，18（33）：2609.

[8] 笔雪燕，刘晓凤，张清波.HPLC法测定清开灵泡腾片中栀子苷的含量[J].中国药房，2011，22（8）：240.