对斜纹夜蛾高效绿僵菌的筛选

马丽娟， 滕忠才， 臧 欢， 刘廷辉，李瑞军＊， 郭 巍， 巩兰菊

（1.河北农业大学植物保护学院，河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，保定 071001；2.保定学院生化系，保定 071000；3.河北省曲周县农牧局，曲周 057250）

对斜纹夜蛾高效绿僵菌的筛选

马丽娟1， 滕忠才2， 臧 欢1， 刘廷辉1，李瑞军1＊， 郭 巍1， 巩兰菊3

（1.河北农业大学植物保护学院，河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，保定 071001；2.保定学院生化系，保定 071000；3.河北省曲周县农牧局，曲周 057250）

对从土壤中分离到的金龟子绿僵菌中生长性状较好的6个菌株，通过测定对黄粉虫幼虫的僵虫率和致死中时，选出3株致病效果好的菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65），再采用点滴法接种对斜纹夜蛾进行毒力测定。结果表明，不同菌株对斜纹夜蛾的毒力与菌株种类有密切关系，3株菌株对斜纹夜蛾的LT50分别为2.70、3.07、5.79d。以此3株菌进行抗高温及抗紫外线试验，菌株M7－9和M7－（16－18）对高温和紫外线都具有较好的抗性，且M7－9对紫外线的抗性强于M7－（16－18），两菌株均具有进一步研究的价值。

金龟子绿僵菌； 斜纹夜蛾； 生物测定； 筛选

斜纹夜蛾［Spodopteralitura（Fabricius）］属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一种世界性分布的重要农业害虫，食性广，繁殖力强，发生为害严重［1］。近年来，斜纹夜蛾已成为各种农作物上的常发性害虫，我国斜纹夜蛾的危害愈加严重，已由过去的间歇性、偶发性、次要性害虫迅速上升为常发性、暴发性的农业大害虫［2］，对农业生产、园林绿化等都造成了严重的损失，在长江流域的棉花和蔬菜上可发生4～6代／年［3］。目前，对于斜纹夜蛾的防治主要依赖于化学农药，然而长期、连续的不加区别地滥用各类化学杀虫剂，已经使得斜纹夜蛾对诸多杀虫剂的活性成分产生不同程度的抗性［4］，甚至产生对多种药物的交叉抗性，使田间防治愈加困难［5］。同时，化学农药毒性高、残留量大，对人们的健康以及环境都存在较大威胁。因此，积极寻找高效低毒的替代方法对斜纹夜蛾进行防治是目前无公害蔬菜生产上亟须解决的问题。

绿僵菌作为当今世界应用最为广泛的一种昆虫病原真菌，因对昆虫的致病力强、寄主范围广，对人、畜、作物无毒害而受到重视［6－9］。目前，已经发现金龟子绿僵菌能够寄生的昆虫有200余种，对有些害虫已开发出绿僵菌杀虫剂，并收到良好防治效果［10］。但由于绿僵菌对环境要求较高，对高温、阳光尤其紫外线高度敏感，阻碍了它作为生物杀虫剂的发展进程。因此，获得具有高毒力、高抗性的菌株将成为今后工作的重中之重。

土壤是绿僵菌资源的宝库，为绿僵菌提供了广泛的生存空间，本实验室通过黄粉虫诱集法从土壤中已分离出150株金龟子绿僵菌。本研究通过对从土壤中分离到的金龟子绿僵菌中生长性状较好的6个菌株进行毒力测定及抗性筛选，旨在获得具有较高毒力及较好抗逆性的菌株，为今后的防治工作提供良好的基础，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试虫源与饲养

黄粉虫［TenebriomolitorLinnaeus］、斜纹夜蛾［Spodopteralitura（Fabricius）］为本实验室人工饲养，饲养条件为温度28～30℃、相对湿度40%～70%、光周期L∥D＝16h∥8h。

1.1.2 供试金龟子绿僵菌菌株

供试6株金龟子绿僵菌为本实验室从各地土壤中分离（表1），用PPDA培养基培养，保存备用。

M7－9 滕庄 葱 2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色M7－（16－18） 郎庄 茄子2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色M7－（64－65） 郎庄 韭菜2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色M7－105 小汲村 甘薯2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色M7－169 西马池 香麦2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色M7－149 南大园 玉米2010－07 －4 3 菌落绒毛状，分生孢子橄榄绿色

1.1.3 培养基

PPDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蛋白胨20g、蒸馏水1 000mL。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤中金龟子绿僵菌的分离

1.2.1.1 土壤采集

选择平整规则的采集地点，每个地点在附近取5个样点，除去表土（2～3cm），选取表层以下20cm内的土壤1kg，除去石块等大的杂物后充分混合，取出一半后混匀，余下的再取出一半混匀，最后取0.5～1kg于塑料袋，附上标签，写明采集地点、采集深度、采集日期、采集地植被等。

1.2.1.2 金龟子绿僵菌的诱集

将供试土样分装于市售的500mL一次性大塑料杯中，每个土样3杯，每杯盛土200g左右，放入3头黄粉虫幼虫，摇动杯子，使土样将虫体覆盖，加入适量无菌水使土样湿度接近饱和，保鲜膜封住杯口，用昆虫针扎小孔若干，室温下保湿培养，逐日观察记载黄粉虫的存活状况和幼虫感病后的症状，若虫体僵硬，体表覆盖有橄榄绿色的粉状物，可初步判定土样中存在金龟子绿僵菌并诱集成功。

1.2.1.3 金龟子绿僵菌的分离纯化及鉴定

将虫体上的分生孢子稀释，于PPDA培养基上画线分离纯化。经显微镜观察其形态，通过分生孢子的颜色、形态及分生孢子梗等特征，在显微镜下进行种类鉴定，确定是金龟子绿僵菌后，挑取菌落斜面培养，保存。

1.2.2 金龟子绿僵菌生物活性测定

1.2.2.1 菌悬液的制备

将菌种先接种于PPDA培养基上，（25±1）℃恒温培养10d，刮取孢子置于研磨器中，用0.05%吐温－80无菌水配制成浓度为1×108个／mL的孢子悬液。

1.2.2.2 6株金龟子绿僵菌菌株对黄粉虫致病力的初步测定

用移液枪吸取上述菌液滴于5龄黄粉虫腹部背板，接种量为10μL，对照组用等量0.05%吐温－80无菌水接种，设3个重复，每个重复15头试虫。处理后放入养虫盒中，用新鲜洋白菜叶片作食料，每天更换1次。在饲养条件下连续观察10d，每天记录试虫的死亡数、僵虫数，用DPS软件进行数据统计分析［11］。

1.2.2.3 3株高毒力金龟子绿僵菌菌株对斜纹夜蛾的毒力测定

选取上述试验中毒力表现较好的 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）金龟子绿僵菌菌株，进一步测定。菌种培养、毒力测定、数据统计分析方法同1.2.2.2，菌悬液孢子浓度范围为1×104～1×108个／mL，试虫为斜纹夜蛾。

1.2.3 金龟子绿僵菌抗逆性试验

1.2.3.1 菌悬液的制备

选上述3株金龟子绿僵菌进行培养，并配制菌悬液，方法同1.2.2.1。顺次稀释，配制成终浓度为1×105个／mL的孢子悬液。

1.2.3.2 高温对绿僵菌菌株的影响

（1）高温处理对绿僵菌分生孢子萌发率的影响

无菌条件下，将孢子悬浮液分装至小烧杯，保鲜膜封口。将烧杯分别置于温度为35、40、45、50℃的水浴锅中处理。处理时间30min。取处理的孢子悬液1μL涂布于PPDA平板培养基，以未经处理为对照，分别设3次重复。置于恒温培养箱中，（25±1）℃条件下培养3d，计成菌落数，计算各菌株各处理的孢子萌发率。

（2）高温处理对绿僵菌菌落生长的影响

取1.2.3.1中处理过的孢子悬液10μL滴到PPDA平板中央，以未经处理为对照，分别设3次重复。置于恒温培养箱中，（25±1）℃条件下培养，自第3天开始测量菌落直径直至第7天，记录数据。

1.2.3.3 紫外线对绿僵菌菌株的影响

（1）紫外处理对绿僵菌分生孢子萌发率的影响

根据胡琼波的方法［12］，吸取孢子悬浮液1μL均匀涂布于PPDA平板，将平板置于超净工作台紫外灯下，分别照射1、2、4、6、10min后，于（25±1）℃恒温培养箱中培养，以未经照射为对照，每个处理设3次重复。培养3d后记录各处理平板中菌落数，计算各菌株各处理的孢子萌发率。

（2）紫外处理对绿僵菌菌落生长的影响

吸取孢子悬浮液10μL滴至PPDA培养基中央，根据胡琼波的方法［12］置于超净工作台紫外灯下，分别照射1、2、4、6、10min，将平板置于（25±1）℃恒温培养箱培养。以未经照射为对照，每个处理设3次重复。培养第3天起测量菌落直径直至第7天，记录数据。

以上数据均用DPS数据处理系统处理［11］，记录其均值、标准差及各处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 6株金龟子绿僵菌菌株对5龄黄粉虫的致病力

6株金龟子绿僵菌菌株对黄粉虫致病力的初步测定结果见表2。由表2可知，供试菌株对黄粉虫均有致病性，致死中时间在2.64～5.14d之间。其中菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）的致死中时分别为2.64、3.51d和3.92d，僵虫率也明显高于其他菌株，与其他绿僵菌菌株间差异显著，显示其具有较高的毒力。

表2 6株金龟子绿僵菌菌株对5龄黄粉虫的致死中时1）

2.2 3株高毒力金龟子绿僵菌菌株对斜纹夜蛾的毒力测定

由表2可知，菌株 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）对黄粉虫的致病力较高。所以选择 M7－9、M7－（16－18）、M7－（64－65）进行对斜纹夜蛾的毒力测定，结果见表3。

表3 3株高毒力金龟子绿僵菌对斜纹夜蛾的致死中时

由表3可知，3株绿僵菌对试虫的致死中时差异较大，不同菌株对斜纹夜蛾的LT50从小到大依次为：M7－9＜M7－（16－18）＜M7－（64－65）。综合测定结果可知，M7－9的致死时间最短，综合防治效果最好，是比较理想的生防菌株。

根据冯明光的方法［13］，运用时间－剂量－死亡率模型（又称 TDM 模型）分析了 M7－9、M7－（16－18）和M7－（64－65）菌株剂量效应随时间变化和时间效应随剂量变化的趋势信息、互作效应。各处理剂量与时间效应参数的t测验值均达到极显著水平（p＜0.01），说明供试菌株的剂量效应与时间效应极显著。根据所估计参数而建立的CLL模型，可以完整地描述所测菌株对斜纹夜蛾的时间与剂量效应，结果见图1。图1模拟的死亡率是一个曲面，根据曲面的变化，在试验范围内，其累计死亡率与处理的孢子剂量、处理后的时间呈正相关，即随着剂量的增加累计死亡率增加，随着时间的延长累计死亡率增加。

图1 斜纹夜蛾在3株金龟子绿僵菌作用下随时间和剂量变化的累计死亡率三维图

2.3 抗逆性试验

2.3.1 高温对绿僵菌菌株的影响

2.3.1.1 高温处理对绿僵菌分生孢子萌发率的影响

高温处理对3株绿僵菌分生孢子萌发率的影响结果见图2。由图2可知，供试菌株对高温处理比较敏感，通过观察，在温度低于45℃时，菌株M7－9和菌株 M7－（16－18）对温度的耐受性都比较明显，分生孢子的萌发率仍可达到80%以上。在温度为45℃时，菌株M7－9分生孢子有45%以上可萌发。

图2 高温处理对绿僵菌分生孢子萌发的影响

2.3.1.2 高温处理对绿僵菌菌落生长的影响

通过培养高温处理后的3株绿僵菌，分别于3～7d测量菌落的生长情况，各菌株对高温的耐受性结果见图3。

通过观察，3株菌在未经处理时，菌落生长差异不明显。随着温度升高，各菌株表现出不同的生长情况，其中菌株 M7－9对高温比较不敏感，在温度为40℃和50℃时都表现出良好的生长态势。结合2.3.1.1中结果，初步推断可能由于高温抑制了孢子萌发时间，但在孢子萌发后，菌株M7－9生长迅速。在温度为40℃和50℃时菌株M7－（16－18）的菌落生长情况优于对照，可能由于特定的温度促进了菌落的生长。

2.3.2 紫外线对绿僵菌菌株的影响

2.3.2.1 紫外处理对绿僵菌分生孢子萌发率的影响

紫外处理对3株绿僵菌分生孢子萌发率的影响结果见图4。可以看出，3株绿僵菌对紫外线处理都比较敏感，随着紫外线照射时间的增加，绿僵菌菌株 分生孢子的萌发率呈递减趋势。

图3 高温处理对绿僵菌菌落生长的影响

图4 紫外处理对绿僵菌分生孢子萌发的影响

2.3.2.2 紫外处理对绿僵菌菌落生长的影响

紫外处理对3株绿僵菌菌落生长的影响结果见图5。

由图5可以看出，3株绿僵菌中，菌株 M7－9对紫外线抗性最好。紫外照射对菌落生长影响相对不明显，菌株 M7－（16－18）对紫外的抗性比较好。菌株M7－（64－65）受紫外线影响较大，在照射10min后培养7d仍没有菌落生长。抗紫外效果由高到低依次为：M7－9＞M7－（16－18）＞M7－（64－65）。

3 结论与讨论

通过比较6株金龟子绿僵菌对5龄黄粉虫的致死中时，获得了3株毒力较高的菌株，经测定它们对斜纹夜蛾的致死中时，筛选出具有较高毒力的菌株M7－9，其对斜纹夜蛾的致死中时为2.70d，大大低于来有鹏、张登峰［14］报道的布氏白僵菌菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫的致死中时4.10d。

通过对菌株 M7－9、M7－（16－18）和 M7－（64－65）进行抗高温和抗紫外线试验，3株绿僵菌中对高温和紫外抗性最好的为M7－9，该菌在温度为40℃和45℃时分生孢子的萌发率分别为81.00%和46.00%，紫外处理10min分生孢子萌发率为28.33%。黄志、梁昌聪［15］等测定了绿僵菌菌株JF－813对高温和紫外线的抗逆性，该菌在温度为40℃和45℃时分生孢子萌发率分别为54.20%和24.2%，紫外处理5min和10min时分生孢子萌发率分别为34.0%和11.9%。本研究所用金龟子绿僵菌菌株由保定地区不同作物土壤中分离获得，这些菌株在室内生物测定中均表现出较强的致死力。尤其是菌株M7－9，除对试虫表现出高致病性外，对高温和紫外线也表现出一定的抗性。这说明保定地区绿僵菌资源丰富、优良，通过筛选获得的金龟子绿僵菌对本地区有害生物防治具有良好的应用前景。

图5 紫外处理对绿僵菌菌落生长的影响

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Screening of high virulence strains ofMetarhiziumanisopliaeagainstSpodopteralitura

Ma Lijuan1， Teng Zhongcai2， Zang Huan1， Liu Tinghui1， Li Ruijun1， Guo Wei1， Gong Lanju3
（1.CollegeofPlantProtection，HebeiAgriculturalUniversity，BiologicalControlCenterofPlant DiseasesandPestsofHebeiProvince，Baoding071001，China；2.DepartmentofBiochemistry，BaodingUniversity，Baoding071000，China；3.AgricultureandAnimalHusbandryBureauofQuzhouCounty，Quzhou057250，China）

Six strains ofMetarhiziumanisopliaewith good growth traits，isolated from soil in Baoding area，were screened againstTenebriomolitorLinnaeus by bioassay.Among them，M7－9，M7－（16－18）and M7－（64－65）strains，which showed higher virulence than other isolates，were selected to test their pathogenicity againstSpodopteralitura（Fabricius）.The LT50of strain M7－9，M7－（16－18）and M7－（64－65）againstS.liturawere 2.70，3.07 and 5.79 d，respectively.The 3strains were then treated with the ultraviolet ray and heat.The results demonstrated that the resistance of M7－9 and M7－（16－18）to high temperature and ultraviolet ray was higher，and the resistance of M7－9 to the ultraviolet ray was higher than that of M7－（16－18）.These results suggested that strains M7－9 and M7－（16－18）have better exploitation and application value in the future.

Metarhiziumanisopliae；Spodopteralitura； bioassay； screen

S 476.12

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.015

2012－01－06

2012－03－23

现代农业产业技术体系（CARS－14）

＊ 通信作者E－mail：liruijun99＠sina.com