抗黑星病芽变鸭梨组织结构、生理生化与抗病性关系研究

刘艳涛， 冯晓洁， 席国成， 蒲宝钟， 王庆雷， 刘春琴

（河北沧州市农林科学院，沧州 061001）

抗黑星病芽变鸭梨组织结构、生理生化与抗病性关系研究

刘艳涛， 冯晓洁， 席国成， 蒲宝钟， 王庆雷， 刘春琴＊

（河北沧州市农林科学院，沧州 061001）

对一株抗黑星病芽变‘鸭梨’的叶片组织结构和生理生化特性进行了研究，发现其叶片蜡质含量高、栅栏组织双层出现时间早、厚度大、海绵组织结构致密、气孔数目少，推断这些特性决定黑星病菌分生孢子不易侵入叶片内部；叶绿素含量高为植株抗病性提供了生理基础，可溶性糖含量低有可能抑制黑星病营养菌丝在细胞间的生长和扩展。通过研究该抗黑星病芽变‘鸭梨’的抗病机理，为‘鸭梨’抗黑星病育种提供了理论依据。

鸭梨； 黑星病； 抗病性； 组织结构； 生理生化

梨黑星病又称疮痂病，是在我国北方梨区发生和危害的一种主要病害，可危害叶片、叶柄、新梢、果实、果柄、芽、花序等部位［1］。发病严重时往往造成大量幼果畸形、果实不能正常膨大、落果、早期大量落叶等，病树第2年结果减少，常在梨生产上造成重大损失［2－3］。不同梨品种间对梨黑星病菌的抗性存在着明显的差异［4－5］，以中国梨最感病。中国梨中的‘鸭梨’尤其容易感染黑星病［6］。因此培育高抗梨黑星病的优良品种，是解决这一问题的关键，是减少农药污染，提高经济效益，生产绿色优质果品的最有效措施。

关于梨叶片组织结构和生理生化与黑星病抗性之间关系，姜淑苓等［7］用‘早金香梨’为材料对其叶片组织结构进行鉴定，认为叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织的致密程度以及表皮蜡质的厚度均与黑星病抗性有关。李保华等［8］认为叶龄与黑星病的侵染和发病均有关系。樊卫国等［9］对部分梨砧木叶片组织结构进行研究，认为叶片组织结构与其抗旱性有相关性。

王跃进等［10］认为葡萄叶片可溶性糖含量与抗黑痘病存在着显著的相关关系；杨光道等［11］也发现油茶果实可溶性糖含量与抗炭疽病之间存在着显著的相关关系。而万贤崇等［12］则认为杨树感染褐斑病初期体内高含量的可溶性糖、还原糖是感病无性系易于感病的重要因素。苏海兰等［13］认为葡萄叶绿素与抗病性有显著相关。刘会宁等［14］对葡萄霜霉病的研究结果也表明叶绿素含量与霜霉病有显著关系。然而冯丽贞［15］以桉树为试验材料结果却表明接种前桉树体内叶绿素含量和叶绿素a／b值与桉树对焦枯病抗性不呈正比；而接种后桉树的叶绿素含量和叶绿素a／b值的变化率却可以反映出桉树抗焦枯病能力的大小。

本试验以沧州泊头市梨园内一株生产栽培表现良好的10年生抗黑星病芽变‘鸭梨’为材料，通过对该抗黑星病芽变‘鸭梨’的组织结构、生理生化方面的研究，分析其与黑星病抗性之间的关系，为‘鸭梨’抗黑星病育种提供理论依据，丰富育种资源；减少农药污染，提高经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料

沧州泊头市梨园内一株10年生抗黑星病芽变‘鸭梨’为鉴定材料，同一梨园内长势一致的普通‘鸭梨’品种为对照。

1.2 方法

1.2.1 抗病性鉴定方法

于下午16：00－17：00或阴雨日进行人工接种，以105个／mL孢子悬浮液喷雾接种叶片，接种后套袋保湿24h，叶片发病后观察、记录发病情况，计算病情指数。

叶片分级标准为：0级为叶片无病斑；1级为病斑面积占整片叶面积的10%以下；3级为病斑面积占整片叶面积的11%～25%；5级为病斑面积占整片叶面积的26%～40%；7级为病斑面积占整片叶面积的41%～65%；9级为病斑面积占整片叶面积的65%以上［16］。

梨黑星病病情指数计算：

抗病性评价标准为：病情指数＜10.0为高抗（HR）；10.0≤病情指数＜25.0为抗病（R）；25.0≤病情指数＜40.0为中抗（M）；40.0≤病情指数＜65.0为感病（S）；病情指数≥65.0为高感（HS）。

1.2.2 叶片组织结构、生理生化鉴定方法

1.2.2.1 蜡质含量测定

参照李海英等的方法［17－18］，取每个品种的新鲜叶片称重后，剪碎，放入40mL的氯仿中浸泡1min，把溶液过滤到已知重量的烧杯中，在通风柜中待氯仿挥发完毕后，再次称重，换算出蜡质含量。

1.2.2.2 叶片气孔观察

每品种观察9片叶，每个叶片选取3片1cm×1cm大小的部位剪下，在等量的95%乙醇和冰醋酸混合液中固定24h，然后浸在饱和水合氯醛水溶液中，待组织透明后，10×40倍显微镜下观察气孔数目；15×40倍显微镜下通过测微尺测量气孔大小。

1.2.2.3 叶片组织结构观察

每叶各取6个不同部位，制作切片，在15×10倍显微镜下测量叶片上、下表皮组织、栅栏组织、海绵组织及整个叶片的厚度，计算细胞结构紧密度。

细胞结构紧密度（CTR）＝

（栅栏组织厚度／叶片厚度）×100%。

1.2.2.4 叶绿素和可溶性糖含量测定

叶绿素含量的测定［19］：取新鲜梨叶，擦净表面污物，剪碎并准确称量0.5g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及3mL 80%丙酮，研磨匀浆，再加入80%丙酮10mL，继续研磨至组织变白，把提取液倒入小烧杯中，加入少量80%丙酮冲洗研钵3次，静置数分钟，用一层经80%丙酮湿润过的滤纸过滤，再用80%丙酮将纸上色素冲洗干净定容于25mL容量瓶中摇匀，每品种均设3次重复。

将上述色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以80%丙酮为空白，在波长663、646、652nm和470nm下测定吸光度。

可溶性糖的测定［19］，称取新鲜梨叶0.3g剪碎混匀，放入20mL试管中，加入10mL蒸馏水并用塑料膜封口，于沸水提取30min过滤，反复漂洗试管及残渣，最后定容至25mL容量瓶中，取待测液0.5mL加入蒽酮乙酸乙酯0.5mL和5mL浓硫酸显色，充分振荡后立即沸水浴1min，自然冷却至室温后用753B型分光光度计在波长620nm下测定吸光度，每品种均设3次重复。

用标准葡萄糖溶液按同样步骤做标准曲线，通过标准曲线查得总糖含量。

2 结果与分析

2.1 ‘鸭梨’抗黑星病鉴定结果

田间正常管理条件下，通过两年的田间调查可知，作为对照的‘鸭梨’（CK），叶片发病率达95%以上，病情指数82，表现为高感；而该芽变‘鸭梨’叶片发病率为6%，病情指数为3，表现为高抗。对照品种‘鸭梨’梨黑星病病叶率为28.0%～70.5%，病果率为25.0%～63.0%。

表1 ‘鸭梨’对梨黑星病抗性鉴定结果1）

2.2 ‘鸭梨’叶片显微结构

图1和图2分别为抗病芽变‘鸭梨’和普通‘鸭梨’（CK）叶片切片后的显微照片，从图1可以看出：5月2日的抗病‘鸭梨’叶片栅栏组织较厚，即为明显的两层，海绵组织致密；而普通‘鸭梨’叶片栅栏组织较薄，仅为一层。从图2可以看出至5月12日抗病芽变‘鸭梨’和普通‘鸭梨’（CK）均为明显的双层栅栏组织。

2.3 ‘鸭梨’组织结构、生理生化指标鉴定结果

从表2可以看出：（1）抗病芽变材料蜡质含量为对照‘鸭梨’的1.2～1.6倍，5月2日、5月12日芽变材料和对照‘鸭梨’的蜡质含量达极显著水平。（2）芽变材料叶片厚度与对照‘鸭梨’厚度相当，但栅栏组织厚度为对照‘鸭梨’的1.2～1.4倍；细胞结构更致密。（3）在整个观察期间芽变材料的气孔数目均比对照‘鸭梨’的气孔数目少，为对照‘鸭梨’的0.8～0.9倍。（4）方差分析表明，芽变材料和对照‘鸭梨’在栅栏组织厚度、细胞结构紧密度、气孔数目方面存在着极显著差异。

从表3可以看出（1）抗病芽变材料叶绿素含量为对照‘鸭梨’的1.3～1.8倍。（2）抗病芽变材料可溶性糖含量在5月12日前为对照‘鸭梨’的0.7～0.8倍；5月12日后猛增到对照‘鸭梨’的1.4倍以上，达到显著水平。

表2 抗病芽变材料与普通‘鸭梨’组织结构比较1）

表3 抗病芽变材料与普通‘鸭梨’生理生化指标比较1）

以上研究结果表明：在相同栽培管理条件下，芽变材料与对照‘鸭梨’相比，（1）蜡质含量高，叶面更光滑，使孢子着落量降低；（2）栅栏组织双层出现时间早，厚度大，海绵组织结构致密，推断病菌分生孢子不易侵入叶片内部；（3）从栽培学角度看，梨树叶片从展叶到发育成熟需要30～40d。10日龄前叶片未完全展开，密生绒毛，孢子着落量低，发病轻；30日龄以后梨叶趋于成熟，毛状体稀疏，叶面光滑，孢子着落量减少，发病也轻［20］。正处于生长发育期的‘鸭梨’叶片抗病性差，易感染黑星病；发育成熟后，抗病性逐渐增强。该芽变‘鸭梨’5月2日即可见双层栅栏组织，栅栏组织厚，气孔数目少，推断芽变‘鸭梨’的抗病性主要表现在早期抗病；（4）叶绿素含量高，为植物生长提供更充分的营养保障，为植株抗病性提供了生理基础；（5）芽变材料可溶性糖含量5月2日前为对照‘鸭梨’的0.7～0.8倍，这是否与抑制黑星病营养菌丝在细胞间的生长和扩展有关还需进一步的研究才能确定。

3 讨论

目前人们普遍认为梨品种对黑星病的抗性受多基因控制，因栽培地区不同抗病性差异很大，中国是世界第一产梨大国，其中‘鸭梨’占全国梨总面积的22%左右，然而‘鸭梨’极易感染黑星病，给生产造成巨大损失。作者通过试验，鉴定沧州泊头市梨园一株10年生‘鸭梨’芽变植株高抗黑星病。通过研究，探讨了该芽变材料的抗病机理，为抗病育种提供科学依据；该芽变材料可作为亲本选育适合该地区的优质高抗黑星病的‘鸭梨’新品种，丰富育种资源，服务农业生产。

相同栽培条件下通过对芽变‘鸭梨’和对照‘鸭梨’叶片组织结构和生理生化指标的比较发现：叶片厚度、栅栏组织厚度、叶绿素和可溶性糖与‘鸭梨’黑星病抗性有密切关系。鲍为民等［21］研究认为不同梨品种的抗病性与其叶片的形态结构、生理生化和对病原物的抑制、抵御有关。蜡质含量高，叶面光滑，使黑星病菌分生孢子着落量降低，起到一定的抗病作用；栅栏组织双层出现时间早，厚度大，气孔数目少是该芽变‘鸭梨’的主要特征，使黑星病菌分生孢子不易侵入叶片内部，起到了抵抗黑星病菌的作用，推断该芽变‘鸭梨’的抗病性主要表现在早期抗病。

抗病品种的叶片对黑星病菌营养菌丝的生长和扩展具有明显的抑制作用［22］。叶绿素含量高，为植物生长提供充分的营养保障，为植株抗病性提供了生理基础；糖是植物光合作用的产物，是植物体内重要的碳水化合物，同时，又是病原菌赖以生存的碳源和能源，因此糖的含量在植物抗病中可能起着重要的作用，可溶性糖含量低有可能抑制黑星病营养菌丝在细胞间的生长和扩展。抗病性是一个十分复杂的过程，组织结构、生理生化是抗病性的一种外在表现。由于试验材料和数据有限，还需要进一步验证。

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Relationships between scab resistance and leaf tissue structure and physiological characteristics of Yali pear with bud mutation

Liu Yantao， Feng Xiaojie， Xi Guocheng， Pu Baozhong， Wang Qinglei， Liu Chunqin
（CangzhouAcademyofAgricultureandForestrySciences，Cangzhou061001，China）

The relationships between the leaf tissue structure and physiological characteristics and scab resistance of Yali pear with bud mutation were studied.The results showed that the content of leaf wax was high.Two－layer palisade tissue was formed earlier and thicker，and the structure of spongy tissue was compact.The stoma number of 10－d leaves was decreased.We concluded that it was difficult forVenturiapirinaconidia to penetrate leaf tissue.Higher chlorophyll content was the physiological basis of plant disease resistance，and lower content of soluble sugar could inhibit the growth and extension of pear scab between cells.By studying the resistance mechanism of Yali pear with bud mutation against scab，the theoretical basis for scab resistance breeding of Yali pear varieties can be revealed.

Yali pear； scab； disease resistance； tissue structure； physiological characteristic

S 432.22

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.006

2011－12－21

2012－03－04

＊ 通信作者E－mail：WQLei02＠163.com