促红细胞生成素对缺氧缺血新生鼠脑组织丙二醛水平及细胞凋亡的影响

张秋月,陈国萍,韩 钢,米 延,李 丽

(1.哈尔滨医科大学附属第一医院新生儿科,黑龙江 哈尔滨 150001;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

缺氧缺血性脑损伤(HIBD)是新生儿常见疾病之一,也是导致新生儿死亡或留有神经系统后遗症的主要原因之一。因此寻找安全、有效地治疗方法一直是国内外研究的热点。已有研究证明氧自由基与缺氧缺血性脑损伤密切相关,近年来许多国内外文献报道促红细胞生成素(EPO)不仅具有促进造血祖细胞增殖分化的作用,而且对缺氧缺血性脑损伤大脑具有神经保护作用[1]。本实验在建立新生大鼠 HIBD模型的基础上 ,外源性给予 EPO进行干预治疗 ,以脂质过氧化的最终产物丙二醛(MDA)水平及神经细胞凋亡指数作为观察指标,旨在对 EPO治疗 HIBD的作用机制进行探讨并为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:选用健康7日龄 Wistar大鼠54只 ,体重11～15g,雌雄不分,由中国医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 主要药品和试剂:促红细胞生成素注射液,沈阳三生制药股份有限公司生产。BCA蛋白浓度测定试剂盒、脂质氧化 (M DA)检测试剂盒、IP细胞裂解液、TUN EL细胞凋亡检测试剂盒,以上均为碧云天生物技术研究所生产。

1.2 方法

1.2.1 缺氧缺血动物模型制备:将大鼠乙醚麻醉后,做颈正中切口,分离右侧颈总动脉后用丝线结扎,缝合皮肤,术后恢复2h,然后置于37℃水浴且通入8%氧气和92%氮气的混合气体的密闭缺氧箱中缺氧 2h[2]。

1.2.2 动物分组及处理:实验动物随机分为假手术组、生理盐水对照组和 EPO治疗组。每组各18只。假手术组只分离右侧颈总动脉,不结扎、不缺氧,亦不给予药物干预;EPO治疗组在制成模型后每天腹腔注射 EPO 5 000U/kg;生理盐水对照组制成模型后每天腹腔注射同体积生理盐水;上述动物均回笼饲养,24h、48h、72h后断头处死每组取6只,取右侧大脑半球。

1.2.3 检测方法:取样本组织加入细胞裂解液,制作组织匀浆,离心后取上清测定。MDA测定采用硫代巴比妥比色法。细胞凋亡检测采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位末端标记法,胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞,高倍镜下着缺血侧皮质区随机选取10个视野,计数 500个细胞,计算阳性率即凋亡指数(AI)。

1.3 统计学分析

2 结果

各组动物脑组织 M DA水平比较见表1。盐水对照组较假手术组 MDA水平增高有显著性差异,EPO治疗组较盐水对照组 MDA水平降低有显著性差异。

表1 各组脑组织 MDA含量(±s,nmol/mg)

表1 各组脑组织 MDA含量(±s,nmol/mg)

△与假手术组比较 P＜0.05;*与盐水对照组比较 P＜0.05。

组别 24h 48h 72h假手术组 8.711± 0.29 9.687± 0.46 9.782± 0.56盐水对照组 14.639± 0.54△ 20.539± 1.19△ 23.237± 0.54△EPO治疗组 10.267± 1.00* 10.502± 0.46* 11.685± 0.74*

各组动物神经细胞凋亡指数比较见表2。盐水对照组较假手术组 AI水平增高有显著性差异,EPO治疗组较盐水对照组 AI水平降低有显著性差异。

表2 各组动物 AI的变化 (±s,%)

表2 各组动物 AI的变化 (±s,%)

△与假手术组比较 P＜0.05;*与盐水对照组比较 P＜0.05。

组别 24h 48h 72h假手术组 7.2± 1.3 2.2± 0.8 1.8±1.1盐水对照组 14.8± 3.7△ 19.4± 2.6△ 15.8± 4.2△EPO治疗组 8.7± 1.5* 10.2± 1.8* 10.3± 2.9*

3 讨论

EPO是一种含唾液酸的酸性糖蛋白,能促进造血祖细胞的增殖分化。EPO在体内不能储存,主要由血氧含量的变化经缺氧诱导因子1(HIF—1)路径来调节其生成。EPO通过EPO受体(EPO-R)发挥生物学效应[3]。目前许多临床及实验研究都显示 EPO不仅影响造血系统,而且在应激时发挥重要的保护机体的作用,对整个生物体发挥广泛的组织保护效应[4],其中中枢神经系统中的神经细胞、星形胶质细胞可通过旁分泌或自分泌方式分泌 EPO,并与附近神经元细胞膜上的 EPO-R结合。在动物实验中,Kumral等[5]证实新生幼鼠脑缺氧缺血后立即给予 EPO治疗,通过 Morris水迷宫测试,长期神经行为能力明显改善。Dzietko等[6]体内实验证实EPO可减少神经元由于缺氧缺血所造成的死亡,其机制是减少经 NMDA受体调节的兴奋性氨基酸神经毒性作用。曾志等[7]发现早期运用外源的 EPO可明显减轻 HIBD大鼠的脑组织损伤程度,保障其脑功能的相对正常。

Calacpai等[8]报道,在大脑缺血后立即腹腔给予重组促红细胞生成素可对丙二醛水平增加、大脑水肿、迟发性神经元凋亡及一氧化氮的过度生成有改善的作用。本研究发现盐水对照组(即 HIBD组 )较假手术组(正常组)MDA含量及 AI明显增高,外源性应用 EPO干预后 HIBD脑组织中 MDA含量及 AI明显降低,与文献一致。MDA为脂质过氧化的最终产物,其水平反映机体细胞氧化损伤的程度。说明可能是缺氧缺血后再灌注导致脑组织产生大量氧自由基,脂质过氧化反应增强,导致 M DA增高。EPO治疗后使 M DA降低可能是通过增加超氧化物歧化酶的活性来减少脂质过氧化物的产生;AI降低机制则可能包括减少 NO过度生成、抑制谷氨酸受体介导的毒性作用及直接增加抗凋亡基因的表达等。

综上所述,EPO可通过抑制丙二醛的增加和神经细胞凋亡来发挥缺氧缺血性脑损伤的保护作用。EPO将为新生儿HIE的治疗提供一个新的途径。

[1]王文益.促红细胞生成素在缺氧缺血性脑病中的神经保护作用[J].重庆医学,2009,38(23):3020-3021

[2]吴婉芳,徐放生,张莉莉,等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型[J].新生儿科杂志,1992,7(6):265

[3]Fontenay Roupie M,Bouscary D,Guesnu M,et al.Ineffective erythropoiesis in myelo(iysplastic syndromes:correlation with Fas expression but not with lack of erythropoietin receptor signal transduction[J].Br Haematol,1999,106(2):464

[4]Buemi M,Cavallaro E,Floccari F,et al.Ery thropoiet nand the brain:from neurod velopn1enl to neuroprotection[J].Clin Sci(I.ond),2002,103(3):275

[5]Kumral A,Gonenc S,Acikgoz O,et al.Erythropoiel inincreases glutathione peroxidase elzyme activity and decreases lipid peroxidation levels in hypoxiciscbemic brain injury in neonatal rats[J].Biol Neonate,2005,87(1):15

[6]Dzietko M,Felderhoff U,Sifringe M,et al.Er5rthropoietin protects the dev eloping brain against N-methyl-D-aspartate receptor antagonist neurotoxicity[J].Neurohiol Dis,2004,15(2):177

[7]曾志,周卓妍,宋燕燕,等.促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 [J].暨南大学学报(医学版),2011,32(2):155-159

[8]Calapai G,Marciano M C,Corica F,et al.Erythropoietin protects against brain ischemic injury by inhibition of nitric oxide formation[J].Eur J Pharmacol,2000,401(3):349-356