固相萃取离子色谱法测定反义寡核苷酸药物杂质*

马金平，仲婕，鲁丹丹，张金钟，施明珠，高婵，朱德领

(1.杭州天龙药业有限公司，310021;2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850)

反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)是一种新型抗肿瘤和抗病毒的靶向治疗药物，由固相合成而得成品。由于在合成和工艺中使用了醋酸(acetic acid，MCAA)、二氯乙酸(dichloroacetic acid，DCAA)等溶剂，纯化工艺中使用了氯化钠，因此有必要建立寡核苷酸原料药中杂质MCAA、DCAA和氯离子(Cl－)的质控方法。目前通用的有机残留测定方法来自于ICH和《中华人民共和国药典》2010年版气相色谱法(GC)[1]，由于MCAA极性大，沸点较高，需要对样品进行衍生化处理，定量结果变异较大，《中华人民共和国药典》2010年版又收载了MCAA残留的液相色谱方法[1]，笔者经实验后发现峰形不好、检测限高，长期用于生产化药物控制对色谱柱有一定损耗;对含卤素的残留溶剂DCAA，GC-FID法灵敏度低，GC-ECD则会受氧元素影响。MCAA和DCAA都是能够离子化的化合物，可在水中离解，离子色谱(IC)是较好的选择，早期国内有文献报道用梯度淋洗IC法分析DCAA和MCAA[2-3]，笔者采用IC等度分析，同时测定寡核苷酸原料药中的杂质MCAA、DCAA和Cl－的含量，方法简单，快捷可靠，线性范围宽，所需试剂少，检测灵敏度高，可为建立ASON质量标准提供技术参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器美国Dionex公司ICS-900型离子色谱仪，抑制型电导检测器，Chromeleon色谱工作站。分析柱:Ionpac AS23(4 mm×250 mm)，保护柱:Ionpac AG23(4 mm×50 mm)。美国Agilent 6890N气相色谱仪，色谱柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。C18固相萃取小柱:WAT020805，Waters Sep-pak C183cc/500 mg。

1.2 试药碳酸氢钠(NaHCO3，Fluka分司生产，批号:0001446842，色谱纯)，无水碳酸钠(Na2CO3，天津市化学试剂研究所生产，优级纯，含量≥99%)，二氯乙酸(Sigma-Alorich公司生产，批号:STBB5017，纯度≥99%)，氯离子标准溶液(1 000 mg·L－1，购自国家标准物质研究中心)，甲醇(MERCK生产，含量≥99.9%，色谱纯)，冰醋酸和浓硫酸均为分析纯，实验中所用的水由Millipore公司Simplieity生产，电阻率＞18.2 MΩ·cm－1的去离子超纯水。寡核苷酸样品由军事医学科学院放射与辐射医学研究所九室提供(FLU批号:20100415，20100420，20100512;CT102批号:20110113-1，20110113-2，20110113-3)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件阴离子色谱分析柱Ionpac AS23(4 mm×250 mm);阴离子色谱保护柱Ionpac AG23(4 mm×50 mm);流动相:0.8 mmol·L－1NaHCO3/4.5 mmol·L－1Na2CO3;电导检测;流速1 mL·min－1;抑制器的抑制电流为25 mA;进样量10 μL。

2.2 对照品储备液的制备

2.2.1 MCAA对照品储备液的配制精密量取MCAA适量，用水定量稀释制成每毫升含MCAA 0.4 μg的溶液，置4℃冰箱备用。

2.2.2 DCAA对照品储备液的配制精密量取DCAA适量，用水定量稀释制成每毫升含DCAA 0.156 μg的溶液，置4℃冰箱备用。

2.2.3 Cl－标准溶液1 000 mg·L－1，购自国家标准物质研究中心。

2.3 样品溶液的制备精密称取样品100 mg，置10 mL量瓶，用水稀释至刻度，用C18固相萃取小柱过滤，即得。

2.4 系统适应性实验取一定浓度的对照品溶液、样品溶液、加对照品的样品溶液，按照“2.1”项色谱条件，各进样10 μL，记录图谱。结果样品中可能含有的化合物均可实现分离，且分离良好。MCAA与Cl－分离度10.26;DCAA与Cl－分离度4.56;理论板数:MCAA 6 173，DCAA 8 143，Cl－9 659;不对称因子:MCAA 1.39，DCAA1.10，Cl－1.15;精密度:MCAA RSD为3.47%，DCAA RSD为0.8343%，Cl－RSD为1.54%。

2.5 标准曲线的绘制

2.5.1 MCAA标准曲线的绘制精密量取MCAA对照品储备液适量，用水分别稀释成0.002，0.004，0.04，0.2，0.4 μg·mL－1标准溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程，MCAA:Y=5.230 7X+0.014(r=0.999 7)。结果MCAA在0.002～0.400 μg·mL－1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5.2 DCAA标准曲线的绘制精密量取DCAA对照品储备液适量，用水分别稀释成0.000 624，0.003 12，0.006 24，0.031 2，0.156 μg·mL－1标准溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程，DCAA:Y=19.762X－0.007 2(r=0.999 9)。结果表明DCAA在0.000 624～0.156 μg·mL－1浓度范围内呈良好的线性关系。

2.5.3 Cl－标准曲线的绘制精密量取Cl－标准溶液适量，用水分别稀释成0.002 4，0.024，0.06，0.3，1.5 mg·mL－1的标准溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程，Cl－:Y=507.4X－0.746 2(r=0.999 8)。结果表明Cl－在2.4×10－3～1.5 mg·mL－1范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度实验取一定浓度的MCAA、DCAA、Cl－对照品溶液，每次进样10 μL，重复进样6次，测得峰面积，MCAA RSD为3.47%(n=6)，DCAA RSD为0.83%(n=6)，Cl－RSD为1.54%(n=6)。

2.7 灵敏度实验

2.7.1 检测限的测定将MCAA对照品溶液逐步稀释，测得MCAA的检测限为0.02 ng·mL－1(S/N=3);将DCAA对照品溶液逐步稀释，测得DCAA的检测限为0.312 ng·mL－1(S/N=3);将Cl－对照品溶液逐步稀释，测得Cl－的检测限为0.01 μg·mL－1(S/N=3)。

2.7.2 定量限的测定将MCAA对照品溶液逐步稀释，测得MCAA的定量限为1 ng·mL－1(S/N=10);将DCAA对照品溶液逐步稀释，测得DCAA的定量限为0.78 ng·m L－1(S/N=10);将Cl－对照品溶液逐步稀释，测得Cl－的定量限为0.04 mg·mL－1(S/N=10)。

2.8 稳定性实验取MCAA、DCAA、Cl－对照品溶液各1份，于室温0，2，4，6，8，10 h后分别进样10 μL，测得峰面积，MCAA的RSD为1.53%，DCAA的RSD为1.88%，Cl－的RSD为1.07%。可见对照品溶液在10 h内稳定。

2.9 IC法与GC法测定MCAA与DCAA的比较研究GC方法:毛细管柱顶空进样系统程序升温法。仪器:美国Agilent 6890N气相色谱仪，色谱柱:HP-5(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。色谱条件:柱温采用程序升温:初温35℃，维持2 min，以20℃·min-1的速率升温至135℃，再以30℃·min-1的速率升温至285℃，维持3 min;进样口温度为280℃;检测器温度为270℃;载气为氢气，采用分流进样模式，分流比8∶1，柱流速1.2 mL·min－1。顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为120 min。顶空进样40 μL，记录色谱图。对照品溶液:精密量取MCAA 119 μL和DCAA 80 μL，置25 mL量瓶，用甲醇溶解稀释至刻度，精密量取1 mL置10 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。

样品衍生:取本品适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释成为100 mg·mL－1的样品溶液，取此溶液1.0 mL，置顶空瓶中，加入对照品溶液1.0 mL，加入浓硫酸0.5 mL，封盖，置于85℃下反应8 h以上。进样:在最佳的顶空条件下(80℃，120 min)使达到气液平衡，手动移取顶空蒸气40 μL进样，结果见表1。

通过表1可以看出IC法较GC法精密度好，定量限、最小检测限低，线性范围宽。

2.10 样品测定

2.10.1 样品定量测定取样品3批，按“2.3”项下方法制备样品溶液，进样10 μL，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图。

2.10.2 样品限度检查精密量取MCAA 7.5 μL置50 mL量瓶，用水稀释至刻度，作为MCAA对照品溶液;精密量取DCAA 4.8 μL置50 mL量瓶，用水稀释至刻度，作为DCAA对照品溶液;精密量取Cl－标准溶液1.5 mL置50 mL量瓶，用水稀释至刻度，作为Cl－对照品溶液。精密量取上述3种溶液各5 mL，摇匀，进样10 μL，按“2.1”项色谱条件测定。

3 讨论

样品中可能含有MCAA、DCAA和Cl－杂质，笔者所选择的色谱系统中，Cl－位于两个残留溶剂MCAA与DCAA之间，3个峰共存情况下，分离度能达到《中华人民共和国药典》2010年版要求，实现完全分离，且可分别定量。

采用该IC法测定寡核苷酸原料药中杂质MCAA、DCAA、Cl－的含量，方法学的线性范围宽、精密度、灵敏度结果都较满意，既能满足残留限度检查的需要，又能在一定范围内作定量分析。

该方法一次进样即可准确定量样品中MCAA(tR=4.757 min)、Cl－(tR=7.540 min)和DCAA(tR=8.977 min)的含量，对于硫代修饰的寡核苷酸(可能有磷酸盐和硫酸盐)，还可以同时测定PO3－4(tR=19.130 min)和SO2－4(tR=21.427 min)的含量，所需试剂少，方法简单、快捷，为固相合成多肽和固相合成寡核苷酸药品杂质控制提供了可靠易行的方法。

根据残留溶剂的限度规定[1]:MCAA 0.5%，DCAA 0.5%，寡核苷酸原料药企业内控标准规定Cl－含量应不高于0.1%，按限度配制对照品溶液和供试品溶液，各组分峰面积小于限度规定的对照品峰面积，且FLU样品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分别为0%，0%，0.000 048%，CT102样品中MCAA、DCAA、Cl－平均含量分别为0%，0%，0.000 08%，说明样品杂质在《中华人民共和国药典》和2010年版企业内控规定的限度范围内。

表1 IC法和GC法测定MCAA与DCAA比较Tab.1The comparative study of IC and GC for determination of MCAA and DCAA

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录55，61－65.

[2]桂建业，张琳.离子色谱法测定饮用水中的5种卤代乙酸[J].色谱，2008，26(1):119－121.

[3]LEON B，BRETT P.Use of temperature programming to improve resolution of inorganic anions，anions，haloacetic acids andoxyhalides in drinking water by suppressed ion chromatography［[J].J Chromatography A，2005，1072(2):207－215.