Bcl-2在盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血早期的变化

李 凤，黄冰玉＊，孙荣江，孙 波

（1.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041；2.东北师范大学人文学院体育教研部；3.吉林大学药学院）

Bcl-2在盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血早期的变化

李 凤1，黄冰玉1＊，孙荣江2，孙 波3

（1.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041；2.东北师范大学人文学院体育教研部；3.吉林大学药学院）

目的 研究Bcl-2在盐酸异丙肾上腺素（Isoprenaline hydrochloride，Iso）诱发大鼠心肌缺血早期的变化。方法注射盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血模型。采用常规染色，免疫组化染色及RT-PCR方法分析Bcl-2基因和蛋白表达。结果Bcl-2mRNA表达结果显示：注射Iso后12h，Bcl-2mRNA表达增加；注射24h后，Bcl-2mRNA表达与较12h有所下降，但相对于正常对照组（P＜0.05）。Bcl-2蛋白表达随病变程度的加重而降低。结论心肌细胞凋亡是心肌缺血的基础，Bcl-2在早期（12-72h）便参与心肌缺血的全过程。

心肌缺血；细胞凋亡；Bcl-2

（ChinJLabDiagn，2012，16：1177）

心肌缺血（myocardial ischemia）是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧量减少，心肌能量代谢不正常，不能维持心脏正常工作的一种病理状态［1］。心脏供血不是一成不变的，而是始终带有波动，但这种波动经机体自身调节，促使血液供需相对恒定，保证心脏的正常工作［2］。如果任何一种原因引发心肌缺血，经机体调节不能满足心脏工作的需要，这就构成了真正意义上的心肌缺血［3］。Bcl-2蛋白是一种细胞凋亡相关蛋白，Bcl-2表达增强可抑制细胞凋亡［4］。本实验从基因和蛋白水平进行研究，旨在探讨注射Iso后，Bcl-2在大鼠心肌缺血早期的变化。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

盐酸异丙肾上腺素注射液（由上海禾丰制药有限公司生产，Iso）；羊抗大鼠Bcl-2单克隆抗体（由博士德公司提供）；SP-9000免疫细胞化学试剂盒（由北京中衫金桥生物技术有限公司提供）；MD-100自动生化分析仪（MD公司）；徕卡4215切片机（上海永傲精密仪器有限公司）；Olympus PM-10AO全自动显微照相装置（广州市得锐丰光电有限公司）。

1.2 实验动物及分组

雄性Wistar清洁级大鼠20只，体重180-220g（由吉林大学实验动物中心提供）。分为正常对照组和Iso组（包括12h，24h和72h组），每组5只。模型组大鼠皮下多点多次注射2mg／kg Iso；正常组注射同体积的生理盐水进行刺激。

1.3 HE组织化学染色

严格按说明书进行。

1.4 Bcl-2蛋白组织化学染色

按免疫组化检测试剂盒操作说明书进行。计算不同时间点各组大鼠心肌组织阳性信号的吸光度（A）。

1.5 半定量 RT-PCR检测Bcl-2mRNA表达

取新鲜冻存心脏组织，按Trizol试剂盒提供方法提取。引物：根据文献及Genbank提供RNA序列确定RT-PCR所用引物。Bcl-2上游GAPDH内参基因上游引物5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下 游 引 物 5’-TCC ACCACCCTG TTG CTG TA-3’；Bcl-2：上 游 引 物 5’-GGGATACTGGAGATGAAGACT-3’，下 游 引 物 5′－CCACCGAACTCAAAGAAGG-3’。94℃变性，退火温度55℃，循环数35，扩增产物长度分别为452 bp和367bp。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下拍照，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，以GAPDH光密度作为参考定量标准，Bcl-2表达量以Bcl-2与GAPDH吸光度（A）之比来表示。

1.6 统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学分析。Bcl-2的表达量用±s表示，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 HE染色结果

正常对照组心肌排列整齐，横纹清晰，胞核明显，无细胞肿胀。注射Iso 12h后，出现界限清晰、多发散在坏死灶。72h后，较12h更为明显，具体结果见图1。

图1 心肌组织HE染色结果（×400）

2.2 Bcl-2免疫组织化学染色结果

Bcl-2免疫组织化学染色结果显示，正常对照组中可见呈浅黄色或棕褐色阳性物质，定位于胞浆中；胞膜也有少量的阳性表达。注射72h后，Bcl-2阳性逐渐降低（P＜0.05），具体结果见图2。

图2 心肌组织免疫组化染色结果 （×400）

2.3 Bcl-2mRNA表达情况

RT-PCR 结 果 显 示，注 射Iso 12h 后，Bcl-2 mRNA表达增高趋势明显，且Bcl-2mRNA表达在12h达高峰（P＜0.01），24h有所下降但仍高于正常对照组（P＜0.05），72h后逐渐得到恢复。见表1及图3。

3 讨论

细胞凋亡现象存在于多种有MF的心脏疾病中，细胞凋亡参与其中［5］。在原发性高血压中，RAAS系统的激活以及容量和压力负荷的增加均可以诱导心肌细胞和心肌间质细胞凋亡，MF与凋亡细胞显著增多系系相关［6］；Hong等［7］用免疫组化方法和扫描电镜研究扩张型心肌病心肌标本时发现心肌细胞减少与炎症和细胞坏死无关，认为心肌细胞以及心肌间质细胞的凋亡可能是主要原因；同时超氧化物可以刺激心脏成纤维细胞增生和TGF-β1表达增多，通过这两方面作用超氧化物可致MF［8］。

表1 心肌组织中Bcl-2的基因和蛋白表达

图3 心肌组织中Bcl-2的基因表达

Bcl-2属于跨膜蛋白，主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上，Bcl-2高表达的细胞能耐受多种细胞毒性因子的杀伤作用。因此在众多凋亡相关基因中Bcl-2是目前最受关注的基因之一；后来人们通过免疫组化，转基因试验等方法充分证明了Bcl-2的抑制凋亡作用［9］。

本实验采用多点多次皮下注射2mg／kg Iso诱发大鼠心肌缺血模型。HE染色结果显示：在注射Iso 12h后出现点状坏死，随时间的延长缺血坏死面积明显增加。这些结果提示：注射2mg／kg Iso可成功地诱发大鼠心肌缺血性坏死。为探讨Bcl-2在盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血早期的变化，本文实验应用免疫组织化学及RT-PCR方法，对缺血性心肌坏死所致MF发生发展过程中，Bcl-2蛋白表达及mRNA表达水平进行早期观察，结果表明：多点多次皮下注射Iso诱发大鼠心肌缺血性坏死后，Bcl-2mRNA在12h达到高峰（P＜0.01），72 h后随有所降低，但仍未恢复到正常水平（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表达随时间的延长，蛋白表达逐渐降低，提示心肌细胞凋亡是心肌缺血的基础，Bcl-2在早期（12-72h）便参与心肌缺血的全过程。

［1］Li C，Gao Y，Xing Y，et al.Fucoidan，a sulfated polysaccharide from brown algae，against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats via regulating the inflammation response［J］.Food and Chemical Toxicology，2011May 27.［Epub ahead of print］.

［2］吴兆苏，主编.心血管系统疾病流行病学及防治［M］.北京：人民卫生出版社，2002.

［3］曲相如.人参皂苷Re对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制［D］.吉林：吉林大学，2008.

［4］周 桔，罗荣保，汤长发，等.Bcl-2蛋白家族和P53基因在细胞凋亡中的调控效应［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（10）：1950.

［5］张召才，杨英珍，陈灏珠.心肌纤维化的研究进展［J］.临床心血管病杂志，2004，20（1）：58.

［6］Varagic J，Frohlich E.D，Díez J，et al.Myocardial fibrosis，impaired coronary hemodynamics，and biventricular dysfunction in salt-loaded［J］.Heart and Circ Physiol，2006，290（4）：H1503.

［7］Hong B K，Kwon H M，Byun K H，et al.Apoptosis in dilated cardiomyopathy［J］.Korean J Intern Med，2000，15（1）：56.

［8］Li P F，Dietz R，Von Harsdorf R.Superoxide induces apoptosis in cardiomyocytes，but proliferation and expression of transforming growth factorbeta1in cardiac fibroblasts［J］.FEBS Lett，1999，448（2）：206.

［9］王健东，潘星华.细胞凋亡调节的分子遗传机制［J］.国外医学·遗传学分册，1996.19（2）：116.

The early change of Bcl-2In the Iso-induced myocardial ischemia in rats

LIFeng，HUANGBing－yu，SUNRongjiang，etal.（TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China）

ObjectiveTo investigate the early change in the Iso-induced myocardial ischemia in rats.MethodsRat myocardial ischemia models were induced by isoproterenol（Iso）injection.Conventional staining，immunohistochemical staining and RT-PCR were used to analyze expression of Bcl-2gene and protein.ResultsBcl-2mRNA arrived peak at 12h（P＜0.05）.Bcl-2protein expression with the severity of disease decreases in 12-72h.ConclusionMyocardial apoptosis is an important reason of Iso-induced myocardial ischemia，Bcl-2had a hand in the whole process in the early myocardial ischemia.

Myocardial Ischemia，apoptosis，Bcl-2

R540.41

A

1007－4287（2012）07－1177－03

＊通讯作者

2011－12－08）