Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

张汉超，马 波

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津医科大学附属天津市第四中心医院 胃肠外科，天津 300140）

Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

张汉超1，马 波2＊

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津医科大学附属天津市第四中心医院 胃肠外科，天津 300140）

目的 观察I型人类免疫缺陷病毒蛋白R（Viral protein R、Vpr）在体外对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及探索Vpr对HT-29细胞存活素（Survivin）表达的调节作用。方法应用腺病毒转染系统将Vpr基因以不同感染复数转染至HT-29细胞。MTT法检测Vpr对HT-29细胞的增殖抑制作用；流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化。逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹（western blot）法检测mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表达。结果实验组可见Vpr蛋白的表达；实验组大肠癌细胞HT-29增殖受到抑制（MOI＝200），从转染72h开始，实验组MTT值与对照组及空载体组比较差异均具有有统计学意义（P＜0.05），随着时间的延长，抑制逐渐增强；转染72h后（MOI＝200），实验组细胞凋亡率与对照组及空载体组比较均差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；实验组处于G2／M期细胞比例与对照组及空载体组比较均差异具有统计学意义（P＜0.05）；转染72h后，实验组（MOI＝50）Survivin基因的mRNA水平及蛋白表达水平与对照组及空载体组（MOI＝200）比较均差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），并且survivin的表达随着MOI的增加而减弱。结论Vpr体外可以诱导细胞HT-29G2／M期阻滞及凋亡从而有效抑制细胞HT-29增殖，其机制可能与Vpr下调Survivin基因的表达有关。Vpr在大肠癌的治疗中具有潜在的应用前景。

HIV-1；病毒蛋白R；大肠癌；细胞周期G2停滞；细胞凋亡；存活素

（ChinJLabDiagn，2012，16：1157）

HIV-1Vpr是HIV-1病毒的非结构性基因之一，它编码的病毒蛋白（Viral protein R、Vpr）分子量为14kD，由96个氨基酸构成。研究显示其具有良好的抗肿瘤前景［1，2］。本实验将Vpr基因转染至人大肠癌细胞HT-29内，探索Vpr对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂Vpr基因序列由上海生物工程技术服务有限公司合成，Ad–Vpr由本实验室构建，滴度达到5×108PFU／ml［3］；MTT 购自美国Sigma公司；Trizol试剂盒购自Invitrogen公司；Western blot所用抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 细胞株培养及转染人大肠癌细胞株HT-29购自自武汉大学中国典型培养物保存中心，培养于含10%胎牛血清（美国Gibco公司）及含青霉素100 U·mL－1、链霉素100mg·L－1的RPMI-l640培养基（美国Gibco公司）中，培养条件为5%CO2，37℃潮湿环境。将对数生长期的细胞分别在无血清培养基条件以转染Ad-Vpr，并以转染 Adv作为模拟感染组，以加入等量RPMI-l640培养基作为对照组（Control），转染8h后，PBS冲洗两次，更换为常规培养基。

1.3 噻唑蓝（MTT）比色法测Vpr对细胞生长的抑制作用取对数生长期细胞，用胰酶-EDT A消化并计数，接种于96孔培养板中，每孔5×103个。24 h后，分别以MOI为200转染Adv，Ad-Vpr或者加入等量RPMI-1640。每组3个复孔。1，2，3，4，5天后，加入20μl MTT（5mg／ml）置37℃培养箱培养4h，弃去液体每孔加入150μL DMSO，室温振荡15min，570nm波长测吸光度值，记录结果。

1.4 流式细胞仪技术检测Vpr对细胞HT-29细胞周期及凋亡的影响HT-29细胞生长至对数生长期，Adv-vpr、Adv（MOI＝100）分别转染细胞，72 h后收集细胞，按DNA周期试剂盒检测细胞周期分布及处于亚二倍体的细胞（凋亡细胞）比例。

1.5 Western blot法检测相关蛋白的表达HT-29细胞生长至对数生长期，转染Adv-Vpr（MOI＝50、100、200），Adv（MOI＝200）72h后分别收集细胞并提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为30μg每孔，积层胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，行SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭1h后，加入一抗（1∶1 000）4℃摇床过夜，TBST洗膜10min×3次，加入HRP标记的二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，TBST洗膜10min×2次及TBS洗膜10min×1后，ECL法显色，Alpha Innotech凝胶成像仪检测结果。

1.6 RT-PCR检测 Survivin mRNA 表达HT-29细胞生长值对数生长期，Adv-Vpr（MOI＝50、100、200），Adv（MOI＝200）转染细胞，72h后收集细胞，应用Trizol提取总mRNA，每份标本重复测3次，以β-actin为内参，Survivin及β-actin的引物序列为：Survivin 上 游 引 物 5’-GAGGAAACTGCGAAGAAAGTG-3’，下 游 引 物 5’-GGTG-GCACCAGGGAATAAA-3’，β-actin上游引物 5’-CCTCGCCTTTGCCGATC-3’，下 游 引 物 5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，PCR 扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB（溴化乙锭）染色。Survivin和β-actin条带灰度比值作为survivin mRNA的相对含量。

1.7 统计学处理采用SPSS 13.0统计学分析软件，计量资料数据以±s表示，n＝3，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Vpr对HT-29细胞增殖的影响Vpr组与Control组吸光度值从第三日开始与Control组或Adv组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），Vpr对细胞HT-29生长抑制率（（1-Vpr组吸光度值／Control组吸光度值）×100%）随着转染时间延长而增加，Adv组无显著生长抑制，Adv组与Control组吸光度值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1）。

图1 Vpr抑制细胞HT-29体外增殖

2.2 免疫印迹证实Vpr效果转染72h后，可见Vpr组细胞表达Vpr蛋白（图2）。

2.3 Vpr对细胞HT-29细胞周期及凋亡的影响转染72h后，Vpr组细胞处于G2／M期细胞比例显著增加，与Control组及Adv组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），凋亡率显著升高，实验组处于亚二倍体的细胞（凋亡细胞）比率与Control组及Adv组比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01）（表1）。

2.4 Vpr对细胞HT-29Survivin mRNA及蛋白表达的影响在mRNA和蛋白水平，Survivin表达随着Ad-Vpr感染复数的增加而降低，MOI 50时，Survivin mRNA表达水平与Control组及Adv组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），Survivin蛋白表示水平与与Control组及Adv组比较差异具有显著统计学意义（P＜0.01）（图2）。

表1 三组细胞凋亡率及细胞周期分布（n＝3；%，mean±SD）

图2 Western blot和RT-PCR分析Survivin基因表达及Vpr蛋白表达情况

3 讨论

大肠癌作为最常见的消化道实体肿瘤之一，由于凋亡抑制所致的原发及继发耐药是其重要致死原因［4］，寻找有效的抗大肠癌药物具有重要意义。本研究体外实验发现Vpr可以有效抑制细胞HT-29的增殖，且随着时间的延长抑制增强。

肿瘤细胞形成了多种机制来逃避细胞增值调节，包括细胞周期调控失调及凋亡抵抗［5］，恢复细胞周期调控点及诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的重要策略。vpr能够有效阻滞细胞HT-29于G2／M期并诱导凋亡。

Survivin是新发现的凋亡抑制蛋白家族（IAPS）的重要成员，是迄今发现的作用最强的凋亡抑制因子，全长14.7Kb，其蛋白分子量大约16.2kD它可以抑制细胞凋亡促进细胞增殖，高表达于包括人大肠癌的多种肿瘤细胞中。在结肠癌组织，Survivin蛋白特异性的高表达，而在癌旁正常的粘膜组织表达极低或不表达［6，7］，这提示Survivin蛋白与大肠癌的发生及发展密切相关，是理想的大肠癌治疗靶基因。

本研究发现Vpr可以显著下调大肠癌细胞HT－29Survivin的表达，Vpr对大肠癌细胞HT-29体外增殖抑制作用可能与Vpr下调HT-29细胞中的Survivin的表达有关。

总之，本研究通过体外实验发现，Vpr对大肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用是通过细胞周期阻滞及诱导其凋亡实现的，Vpr对细胞HT-29体外增殖抑制作用可能与Vpr下调HT-29细胞中的Survivin的表达有关。Vpr对大肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用还需利用动物模型进行体内试验，其影响细胞周期及细胞凋亡的信号通路尚须进一步深入研究。

［1］Zhang B，Feng X，Wang J，et al.Combined Antitumor Effect of AdbFGF-siRNA and Ad-Vpr on the Growth of Xenograft Glioma in Nude Mouse Model［J］.Pathol Oncol Res，2010.

［2］冯学泉，王金环，徐新女，等.重组腺病毒Vpr诱导脑胶质瘤细胞凋亡的体外研究［J］.中华神经外科杂志，2010，26（6）：553.

［3］冯学泉，徐军，王金环，等.LR重组法构建重组腺病毒rAd5-Vpr［J］.天津医药，2008（11）.

［4］Zhang Y，Yuan J，Zhang H Y，et al.Natural resistance to apoptosis correlates with resistance to chemotherapy in colorectal cancer cells［J］.Clin Exp Med，2011.

［5］D.Hanahan，R.A.Weinberg，Cell，100（2000）：57.

［6］Liang Q L，Wang B R，Li G H.DcR3and survivin are highly expressed in colorectal carcinoma and closely correlated to its clinicopathologic parameters［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2009，10（9）：675.

［7］田智丹，焦学信，任勇亚，等.survivin、cyclin D1在结直肠癌组织中的表达及其临床意义［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2010（1）：12.

Inhibition of the proliferation of HT-29and the expression of survivin in HT-29cells by Vpr

ZHANGHan-chao1，MA Bo2＊.（1.TianjinUniversityofTCM，Tianjin300193，China；2.DepartmentofGastrointestinalSurgery，Tianjin FourthCenterHospital，AffiliatedTianjinMedicalUniversity，Tianjin300140，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Vpr on proliferation of HT-29and expression of Survivin gene.MethodsHT-29cells were treated with Ad-Vpr or Adv for five days，The cell proliferation was measured by MTT assay everyday.72hpost treatment，Flow cytometry（FCM）was employed to detect the cell cycle distribution and apoptosis.The expression of Vpr protein was detected by western blot；The rnRNA and protein expression levels of Survivin was determined by RT-PCR or Western blot.ResultsMTT showed that Vpr significantly inhibited the proliferation of HT-29cells（72hpost treatment，MOI＝200P＜0.05vs.control or Adv group）in a time dependent manner.The results of FCM showed that Vpr markedly increased the ratio of apoptosis（72hpost treatment，MOI＝200，P＜0.01vs.control or Adv group）and cells in G2／M cell cycle（72hpost treatment，MOI＝200，P＜0.05vs.control or Adv group）.RT-PCR and Western blot showed that Vpr significant1ly downregulated the expression levels of Survivin（72h post treatment，MOI：50，P＜0.05orP＜0.01vs.control or Adv（MOI＝200）group）.ConclusionVpr inhibits the proliferation of HT-29in vitro by inducing cell cycle arrest and apoptosis.and Vpr significant1ly downregulated the expression of survivin.Vpr is a potential anticancer agent for colorectal cancer.

HIV-1；Vpr；colorectal cancer；G2／M arrest；apoptosis；survivin

R735.3

A

1007－4287（2012）07－1157－03

＊通讯作者

2011－08－07）