酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

罗深恒，许丽红，楚 雯，马 岳，刁爱坡

(天津科技大学生物工程学院，天津300457)

前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protein，androgen induced 1)N-端含有1个跨膜区，由252个氨基酸组成，在正常的前列腺组织大量表达，在前列腺癌细胞中表达量低，且表达水平受雄激素的调控［1-2］，如经雄激素抑制剂处理雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP，PMEPA1表达明显下降［3］．说明PMEPAl是一个雄激素诱导负调节前列腺癌细胞生长的基因，通过DNA甲基化介导的表达沉默在前列腺癌的发生过程中发挥重要的作用［4］．

Nedd4(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated gene 4)属于泛素连接酶家族的一员［5］，Nedd4泛素化与PMEPA1互作，其功能还不清楚［2，6］．

本研究利用酵母双杂交技术从人cDNA文库中筛选PMEPA1的互作蛋白，进一步研究PMEPA1蛋白质间互作在前列腺癌细胞癌变中的作用，为探索治疗前列腺癌的新方法提供科学理论依据．

1 材料与方法

1．1 材料

大肠杆菌Top10和BL21-RIPL感受态细胞，纯化重组蛋白 His-PMEPA1、GST-Nedd4、GSTGolgin84，PMEPA1兔多克隆抗体，由本实验室制备和保存;酵母双杂交系统试剂盒(含表达载体pGBKT7质粒，pGADT7质粒)和酵母菌株Y187(含人cDNA文库)，Y2H Gold均购自Clontech公司;内切酶NdeⅠ、Eco RⅠ及T4DNA连接酶，PCR高保真酶pfu、Taq酶购自Fermentas公司;DNA纯化和小提质粒提取试剂盒购自天根公司;酵母质粒提取试剂盒购自Clontech公司;谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱购自 GE healthcare公司;YPD、-Trp Do Supplement、-Leu-Trp Do Supplement、-Leu-Trp-His-Ade Do Supplement、X- α -Gal、Aureobasidin A 为Clontech公司产品．

1．2 方法

1．2．1 诱饵蛋白载体的构建 以人PMEPA1基因为模版，上游引物:5’-CACTACAAGCTG TGTCTG-3’，下游引物 5’--3’．PCR 扩增PMEPA1序列，下划线酶切位点分别为NdeⅠ和Eco RⅠ．PCR反应程序:95℃预变性2 min;95℃变性30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸90 s，30 个循环;72℃延伸5 min;4℃保存．产物用质量分数1%的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收目的DNA片段后利用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切，随后与经酶切好的pGBKT7载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态，经卡那霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，提取转化子质粒进行PCR和酶切鉴定后，由北京华大基因公司测序鉴定．

1．2．2 免疫印迹检测诱饵蛋白的表达 参照Clontech说明的乙酸锂法将诱饵载体pGBKT7-PME-PA1和空载体pGBKT7分别转化酵母菌Y2H Gold，涂布SD/-Trp固体培养基，30℃培养2～3 d后，挑取转化子在50mL SD/-Trp培养液中培养20～24 h．裂解菌体并提取酵母菌蛋白，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后直接经半干法将蛋白转到硝酸纤维素膜上，用一抗PMEPA1兔多克隆抗体和二抗Alexa680标记羊抗兔IgG(Invitrogen)免疫印迹检测PMEPA1在酵母菌中的表达．

1．2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测 将构建好的pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7空载体分别转化到酵母 Y2H Gold中，同时在 SD/-Trp和 SD/-Trp/X-α-Gal/-Aba固体培养基上培养3～5 d后观察，比较菌落生长情况，确定蛋白是否有自激活作用和菌体毒性．

1．2．4 诱饵质粒与文库的杂交筛选 转化诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1到酵母Y2H Gold中，在SD/-Trp液体培养基中培养至OD600=0．8，离心，收集菌体，用5 mL新鲜SD/-Trp液体培养基重悬，加入1 mL含有文库质粒的酵母菌Y187，加入45 mL 2×YPDA培养基在30℃，30～50 r/min，培养20～24 h．离心，菌体用5 mL 0．5×YPDA重悬后，按200μL/板均匀涂布于直径150 mm的SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/-Aba(DDO/X/A)的平板上(约30块)，30℃倒置培养3～5 d．转移≥2 mm的阳性克隆到SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)平板上，30℃倒置培养3～5 d，然后根据酵母在不同缺陷型培养基上的表型分析结果并鉴定阳性克隆．提取能同时激活4个报告基因的阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌Top10感受态，经氨苄霉素抗性筛选，提取猎物质粒．

1．2．5 阳性克隆的复转验证和序列分析 将候选的质粒与pGBKT7-PMEPA1重新共转至酵母Y2H Gold中，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮筛选后确定复转阳性的质粒，并送公司测序，序列结果用Research和NCBI上BLAST等工具进行分析．

1．2．6 GST Pull-down实验 以 pGADT7-dynactin6为模板，上游引物:5’GAGAAGACTCAAAA GAGTG-3’，下游引物:5’-

TTAGTTCTTTACTGGAGTTG-3’，PCR扩增Dynactin6基因，经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，与载体pGEX-4T-2连接构建pGEX-4T-2-Dynactin6重组质粒．转化大肠杆菌BL21-RIPL感受态细胞，使用终浓度为1mmol/L的IPTG，16℃诱导过夜，细菌收集后使用裂解液重悬，超声破碎细胞，12 000 r/min离心15 min，收集上清，上清与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，经PBS洗涤3次，用20 mmol/L的还原性谷胱甘肽洗脱，再经PD10柱除盐．

以Nedd4+PMEPA1为阳性对照，Golgin84+PMEPA1为阴性对照．取5μg纯化蛋白GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GST-Golgin84 分别与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，各加入0．5μg的His-PMEPA1于4℃孵育2 h，裂解液洗涤3次，离心弃上清，加入40 μL SDS上样缓冲液，western印迹检测．

2 结果与分析

2．1 诱饵质粒pGBKT7-PM EPA1的构建和鉴定

根据Genebank中编号为199169．1的PMEPA1基因序列，利用PCR扩增不含跨膜区的PMEPA1序列，获得约690 bp的目的片段，PCR产物经纯化后用NdeⅠ和Eco RⅠ进行双酶切后连接到pGBKT7载体上，转化大肠杆菌Top10感受态，PCR和酶切验证(图1)，目的片段和质粒大小正确．测序结果表明重组质粒读码框架正确，可用于酵母双杂交筛选．

图1 重组质粒的PCR(A)和酶切验证(B)Figure 1 Identification by PCR(A)and enzyme digestion(B)of recombinant plasmid

2．2 诱饵蛋白的表达

将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7载体分别转化酵母菌Y2H Gold，扩增培养后提取酵母菌蛋白，免疫印迹检测结果显示，转入诱饵载体pGBKT7-PMEPA1的酵母菌中有外源蛋白PMEPA1表达，而转入空载体pGBKT7的酵母菌中未检测到PMEPA1表达(图2)，表明人PMEPA1蛋白成功在酵母菌Y2H Gold中表达，可以利用酵母双杂交系统从人cDNA文库中筛选潜在的互作蛋白．

2．3 诱饵蛋白的毒性和自激活检测

将pGBKT7-PMEPA1和pGBKT7转化酵母菌Y2H Gold后，涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-gal/-Aba缺陷培养基上培养3～5 d．转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp上均能正常生长(图3)，表明蛋白没有菌体毒性;转化诱饵载体pGBKT7-PMEPA1和空载体pGBKT7的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/-Aba上均不能生长，结果与预期一致，表明诱饵蛋白不具有自激活的活性．

图2 诱饵蛋白的表达检测Figure 2 Expression assays of bait protein

图3 诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的毒性和自激活检测Figure 3 Toxicity and auto-activation assays of bait plasmid

2．4 人cDNA文库的筛选和阳性克隆的鉴定

将含有人cDNA文库质粒的酵母菌Y187和含有诱饵质粒pGBKT7-PMEPA1的酵母菌Y2H Gold，在SD/Trp-/-Leu/X-α -gal/-Aba(DDO/X/A)缺陷培养基(150 mm)上共培养3～5 d，得到138个阳性转化子，挑取阳性转化子进行His、Ade的表型分析，将阳性转化子转接到 SD/Trp-/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/-Aba(QDO/X/A)缺陷培养基(100 mm)上培养3～5 d，结果获得78个阳性克隆．提取质粒转化大肠杆菌Top10感受态细胞，经过氨苄霉素抗性筛选获得猎物质粒，随后与pGBKT7-PMEPA1共转酵母Y2H Gold，经DDO/X/A和QDO/X/A等2轮复转验证后，得到17个阳性的质粒(图4)．测序后获得3个阳性克隆，表明均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因．

2．5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用

纯化蛋白 GST-Dynactin6、GST-Nedd4、GSTGolgin84分别与与谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱结合后，与His-PMEPA1蛋白共孵育后，结合物经SDSPAGE电泳分离后，用PMEPA1抗体进行 Western blotting检测．Nedd4+PMEPA1泳道为阳性对照，Golgin84+PMEPA1泳道为阴性对照(图5)，Dynactin6+PMEPA1泳道检测到PMEPA1，表明Dynactin6与PMEPA1蛋白存在相互作用，进一步验证了酵母双杂交的筛选结果．

图4 缺陷培养基筛选阳性质粒Figure 4 Screening of positive plasmids on dropoutmedia

图5 GST pull-down验证PMEPA1与Dynactin6相互作用Figure 5 Identification of interaction by GST pull-down

3 讨论

研究蛋白相互作用的方法很多，其中酵母双杂交技术一直被认为是最为灵敏和可信的方法之一．本研究利用GAL4酵母双杂交系统，酵母菌Y2H Gold具有4个报告基因(ADE2，HIS3，MEL1，AUR1-C)，它们在蛋白质发生相互作用形成完整GAL4结构时被激活表达，作者以PMEPA1-GAL4 DNA结合域融合蛋白为诱饵，筛选用GAL4转录激活域构建的人cDNA文库．通过对人cDNA文库进行选择性平板筛选，及测序和序列分析，确定了3个阳性克隆，均为编码动力蛋白激活蛋白Dynactin6基因，GST pull-down实验也进一步验证PMEPA1与Dynactin6蛋白间的相互作用(图5)．

Nedd4基因片段较大(为2．7 kb)，并且其3’非编码区有3 kb，导致筛选用的cDNA文库中没有含Nedd4基因片段．

PMEPA1是一个前列腺跨膜蛋白，在前列腺中大量表达，而PMEPA1蛋白在前列腺细胞癌变过程中表达水平明显下降或者缺失［6］．Nedd4能够通过泛素依赖蛋白酶体介导的蛋白降解，对细胞分化、增殖、凋亡等过程起着重要的作用．

动力蛋白激活蛋白Dynactin复合体是真核细胞中由多亚基组成的蛋白复合物，与动力蛋白dynein结合，使其沿微管做长距离囊泡运输，并且在细胞有丝分裂及分化成熟中发挥重要作用［7］．组成Dynactin复合体的亚基按其结构特点分为3类:(1)长臂样结构亚基蛋白:DCTN1，DCTN 2和DCTN3;(2)Arp1棒状结构亚基蛋白:Arp1，actin，CapZ;(3)尖末端亚基蛋白:Arp11，DCTN4，DCTN5，DCTN6［8］．DCTN 1直接与动力蛋白和微管结合，对Dynactin复合体的结构和功能维护发挥至关重要的作用;DCTN2影响微管到中心体的锚固［9］;DCTN4直接结合Arp1亚基［10］．Arp1亚基已经被证明是 Dynactin复合体和囊泡结构(如高尔基体)连接的结构域［11］．

动力蛋白在细胞内膜细胞器运输中有重要功能［12］．PMEPA1 是高尔基体相关的跨膜蛋白［6］，在胞内体上也有定位［13］，本研究结果暗示动力蛋白激活蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在高尔基体和胞内体间的运输．

［1］RICHTER E，SRIVASTAVA S，DOBIA．Androgen receptor and prostate cancer［J］．Prostate Cancer P D，2007，10(2):114-118．

［2］LIH，XU L L，MASUDA K，et al．A feedback loop between the androgen receptor and a NEDD4-binding protein，PMEPA1，in prostate cancer cells［J］．J Biol Chem，2008，283(43):28988-28995．

［3］BUEHLER P，FISCHER T，WOLFP，etal．Comparison of gene expression in LNCaP prostate cancer cells after treatmentwith bicalutamide or 5-alpha-reductase inhibitors［J］．Urol INT，2010，84(2):203-211．

［4］RICHTER E，MASUDA K，COOk C，et al．A role for DNA methylation in regulating the growth suppressor PMEPA1 gene in prostate cancer［J］． Epigenetics，2007，2(2):100-109．

［5］WANG X，TROTMAN L C，KOPPIE T，et al．NEDD4-1 is a proto-oncogenic ubiquitin ligase for PTEN［J］．Cell，2007，128(1):129-139．

［6］XU L L，SHIY，PETROVICSG，et al．PMEPAI，an androgen-regulated NEDD4-binding protein，exhibits cell growth inhibitory function and decreased expression during prostate cancer progression［J］．Cancer Res，2003，63(15):4299-4304．

［7］SPUDICH JA，GERHART J，MCKNIGHT S L，et al．Dynactin［J］．Annual Review of Cell and Developmental Biology，2004(20):759-779．

［8］ECKLEY DM，GILL SR，MELKONIAN K A，etal．A-nalysis of dynactin subcomplexes reveals a novel actinrelated protein associated with the Arp1 minifilament pointed end［J］．JCell Biol，1999，147(2):307-320．

［9］UETAKE Y，TERADA Y，MATULIENE J，et al．Interaction of Cep135 with a p50 dynactin subunit in mammalian centrosomes［J］．Cell Motil Cytoskel，2004，58(1):53-66．

［10］KARKIS，TOKITOM K，HOLAZBAUR E L．A dynactin subunit with a highly conserved cysteine-rich motif interacts directily with Arp1［J］．JBiol Chem，2000，275(7):43-48．

［11］HOLLERAN E A，TOKITO M K，KARKI S，et al．Centractin(ARP1)associates with spectrin revealing a potential mechanism to link dynactin to intracellular organelles［J］．JCell Biol，2001，135:1815-1829．

［12］翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学［M］．北京:高等教育出版社，2011．

［13］YUKIHIDEW，SUSUMU I，TOSHIYASU G．TMEPAI，a trans membrane TGF-b-inducible protein，sequesters smad proteins from active participation in TGF-b signaling［J］．Mol Cell，2010，37(1):123-134．