DC-CIK联合吉非替尼对A549细胞抑制作用分析

侯燕军 张雷 吴启龙 薛利利

分子靶向和免疫治疗在治疗肿瘤方面取得了重大疗效，常用于肺癌的治疗。由于吸烟，空气污染，电离辐射等因素影响，肺癌的发生率及死亡率逐年上升肺癌占所有癌症致死人数的比例超过1/5，并有上升趋势[1]。本实验旨在探索生物免疫治疗与分子靶向治疗的协同关系现报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料 吉非替尼(国药准字J20100014)由阿斯利康公司提供;A549人类肺腺癌细胞株由上海研生生物工程有限公司提供;DC-CIK共同培养为我细胞培养室自制，培养基为RPMI-1640由Hyclone提供;MTT仪器为上海华舜生物工程有限公司提供;胎牛血清由杭州四季清公司提供;Annexin-V/FIFC试剂盒由南京凯基生物科技有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 DC-CIK制备 采集健康志愿者外周血离心获得单个核细胞。反复冻融裂解法制备抗原。室温下培养3h后贴壁者做DC细胞培养，未贴壁者做CIK细胞培养。培养第9天以DC/CIK=1:5进行混合培养。

1.2.2 A549细胞培养 用Hyclone提供的含10%胎牛血清RPMI/1640的培养液于37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养A459细胞，2 d/次换液。细胞成片后作1/2传代。

1.2.3 细胞抑制率测定 将对数期生长的A549细胞用MTT法计数后种于96孔板内，标准为每孔0.5×105。分为DC-CIK组、吉非替尼组、DC-CIK联合吉非替尼A、B组(A组吉非替尼6.9umol/L;B组非替尼13.8umol/L)，培养24h待A549细胞贴壁，取出培养板，去除培养液，洗涤2～3次后，碱化标本，在570nm处测定OD值，每组实验取4孔求平均值，根据添加药物前后细胞计数的变化计数每组的抑制率。

1.2.4 细胞周期及凋亡情况测定 ①细胞凋亡测定:取对数生长期细胞，接种于6孔板中，培养后，收集细胞以1500r/min离心 5 min，弃上清，加入10 μl AnnexinV-FITC 和5μlPI轻轻混匀;室温避光孵育 15min，后进行流式细胞仪检测，CellQuest软件分析细胞凋亡率。②细胞周期测定:取对数生长期细胞，接种于6孔板中。收集细胞，用冰PBS洗2遍，70%冰乙醇固定标本24 h后重复用冰PBS洗2遍，用500ul Binding Buffer重悬细胞。加入RNA酶使其终浓度达到100 μg/ml，后37℃水浴30 min，最后加入 PI使其浓度达50 μg/ml后4℃避光30 min，流式细胞仪检测分析细胞周期。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 13.0对观察的数据进行分析处理。

2 结果

吉非替尼组对A549细胞的抑制率最低为(37.19±1.5)%，DC-CIK联合吉非替尼B组抑制率最高为(69.62±2.30)%，各组实验结果差异显著，有统计学意义，P＜0.05。

表1 各组实验对A549细胞的周期凋亡影响(%)

表2 各组实验对A549细胞的周期凋亡影响(%)

3 讨论

随着社会科技的迅猛发展，环境污染逐渐严重加上吸烟等因素导致肺癌发病率逐年上升，非小细胞肺癌占肺癌总数的80%～85%，所以非小细胞肺癌的治疗已是迫在眉睫的重要任务。树突状细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞，能摄取、加工并呈递抗原给T细胞引发细胞免疫。CIK细胞是免疫反应中的非特异性杀伤细胞，可由多种细胞因子诱导T细胞分泌，CIK细胞可迅速分泌多种免疫因子参与免疫反应。而将树突状细胞与CIK细胞联合培养后可促进CIK细胞成熟，增强CIK细胞的杀伤力可以确保高效的免疫反应[2]。吉非替尼是酪氨酸激酶的抑制剂，用于非小细胞肺癌的治疗。两者合用对非小细胞肺癌起明显作用的机制可能因为肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)活化受到抑制的因素。因为肿瘤相关成纤维细胞活化后会促进肿瘤细胞的转移扩散，增加了肿瘤细胞的恶性表型，并对肿瘤血管的生长，浸润起促进作用。对于两者如何作用于肿瘤相关成纤维细胞笔者将进一步实验论证。

[1]尤长宣，李金瀚.28例吉非替尼一线治疗老年非小细胞肺癌的临床经验．中国肿瘤临床，2010，37(11):34-35．

[2]葛薇，张伟.树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养增强其体内外抗肿瘤活性．中华血液学杂志，2004，25(5):117．