脐带血间质干细胞生物学特性研究

2012-08-16王英赵亚清高洪泉缪智辉叶子坚

中国实用医药 2012年31期

关键词：盖玻片胞浆脐血

王英赵亚清高洪泉缪智辉叶子坚

本文旨在探讨从人脐带静脉血是否可分离出基质干细胞，如果可以，确定它们的特性，方法是采用不支持造血干细胞生长的培养基培养脐血单个核细胞，对其生物学特性进行研究。

1 资料与方法

1.1 12份脐血采至厦门市中山医院，每份30～60ml。

1.2 基质细胞的分离与培养经新生儿父母同意，于厦门市中山医院采集正常足月新生儿脐带血12份，用L-DMEM培养液悬浮制备好的细胞，接种于25cm2培养瓶中培养。细胞达到70%汇合时进行传代。

1.3 形态学观察与生长曲线绘制每日于倒置显微镜下观察细胞形态与增殖情况，拍照。对于脐血贴壁采用连续照相计数细胞数目21～30 d，描绘细胞生长曲线。

1.4 贴壁细胞鉴定取第2代的脐带血基质干细胞，PBS液冲洗3遍，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液消化后，1000 r/min离心10 min，用PBS冲洗，调节细胞浓度为1×105/ml，接种在放置有盖玻片的24孔板内，待细胞生长至融合状态时，取出盖玻片，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，而后按照试剂盒说明进行免疫细胞化学染色，分为4份，分别滴加兔抗鼠 CD34、CD44、CD49 d、CD106一抗。1∶100稀释，加入50 ul于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜，隔天用PBS冲洗3次后，加入辣根过氧化酶标记的二抗50 ul，1∶200稀释，37℃作用2 h后，用PBS洗涤3次，用SABC显色试剂盒显色，倒置显微镜下观察拍照。

2 结果

2.1 脐血贴壁细胞形态学结果 12份脐血于细胞培养后48h在倒置显微镜下观察全部可见散在的单个贴壁细胞，数量较少，体积较其他细胞大，呈短梭形、针形或三角形，细胞边界折光性强。其中有6份脐血贴壁细胞增殖迅速，第5d时贴壁细胞呈克隆样生长，形成20～50个细胞的集落，并能维持成纤维细胞样形态(图1)，以后细胞数量继续增加，其中2例14～21 d细胞达80%汇合，4例30 d达70%汇合。而另外6份脐血贴壁细胞增殖缓慢，以大圆形或椭圆形细胞为主，长梭形细胞较少，以后细胞体积逐渐增大，形态由梭形逐渐转变为呈圆形或椭圆形，10 d后细胞边界变清晰，胞浆内出现颗粒状物质，21 d以后细胞未能达到汇合，并趋向死亡。细胞传代后可见生长停滞，细胞体积逐渐增大，形状有梭形变为圆形或椭圆形，后期细胞膜破裂，细胞崩解死亡。

2.2 生长曲线由图2可见脐血基质细胞原代细胞生长情况，1～3d增殖较慢，5d后细胞增殖加速，2周后速度又减慢，细胞平均倍增时间为42 h。

2.3 贴壁细胞鉴定对第2代贴壁细胞通过免疫细胞化学染色检测了CD44、CD106四个细胞表面标记，结果显示贴壁细胞CD44阳性表达，细胞胞浆呈现棕黄色(图3);而CD106为阴性表达，大部分细胞胞浆未着色，细胞核蓝染(图4)。说明贴壁细胞为脐带血基质干细胞。