啤酒酵母菌种改良方法

邱秀文，吴晓玉，郭晓燕，王园秀

（江西农业大学生物科学与工程学院，南昌市发酵应用技术重点实验室，江西南昌330045）

啤酒酵母菌种改良方法

邱秀文，吴晓玉，郭晓燕*，王园秀

（江西农业大学生物科学与工程学院，南昌市发酵应用技术重点实验室，江西南昌330045）

啤酒酵母对啤酒的品质、风味具有很大的影响。优良的啤酒酵母是生产优质啤酒的关键因素。从分离纯化、物理诱变育种、化学诱变育种、杂交与融合育种和基因工程育种等方面对啤酒酵母选育的方法及研究进展进行了综合阐述。

啤酒酵母；改良；进展

Abstract:Yeast plays a very important role in beer quality and flavor.Good yeast is a key factor in producting high quality beer.In this paper,some yeast breeding methods was discussed,such as screening and purification,physical mutation breeding,chemical mutagenesis breeding,hybrid and fusion breeding,genetic engineering,and provided a reference for the beer yeast of selection.

Key words：beer yeast;improvement;advance

啤酒是当前最受欢迎的饮料之一，啤酒的质量与啤酒酵母菌种和原料息息相关。啤酒酵母是啤酒工业的灵魂，它的优劣直接关系着啤酒质量的高低，在生产中选育优良酵母是啤酒企业十分重要的工作[1]。然而，受各方面因素的影响，酵母菌种在生产过程中会发生变异或衰老，进而影响啤酒质量，因此啤酒酵母的选育尤其重要[2]。

啤酒酵母是影响啤酒风味稳定性最重要的因素之一，主要是因为酵母在啤酒发酵过程中会产生许多羰基化合物导致异味，不利于保持啤酒风味稳定性[3-4]。啤酒酵母也会产生一些如还原型谷胱甘肽（GSH）和亚硫酸盐等抗老化功能的还原性物质。生产上需要筛选出低产羰基化合物而高产还原性物质的抗老化啤酒酵母，这对于从根本上提高啤酒的风味稳定性具有重要意义[5]。在发酵过程中，酵母也在一定程度上影响啤酒泡沫的持久性及口感[6]。

啤酒酵母的分离纯化及选育决定了啤酒酵母的优良性状及其纯度。优良的啤酒菌种直接影响啤酒发酵液的口感、风味和发酵度[7]。目前，啤酒生产中存在一些问题，如双乙酰含量高、硫化氢含量高、杂醇油含量高、凝聚性差、低蛋白酶等等。生产上有针对性的筛选具有发酵度较高、总高级醇生成量适中、双乙酰还原速度快、低产乙醛、遗传性稳定等特性的优良菌种具有重要意义。因此，啤酒酵母选育对啤酒工业生产有着重要作用。

用于酿造啤酒的酵母，多为酿酒酵母（Sac-charomyces cerevisiae）的不同品种。国外研究者在1883年开始分离培养酵母并用于啤酒酿造。啤酒酵母在麦芽汁琼脂培养基上菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐。无性繁殖以芽殖为主。啤酒酵母能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵乳糖和蜜二糖。按细胞长与宽的比例，可将酿酒酵母分为三类。第一类的细胞多为圆形、卵圆形或卵形（细胞长/宽＜2），主要用于酒精发酵、饮料酒?酿造和面包生产。第二类的细胞形状以卵形和长卵形为主，也有圆或短卵形细胞（细胞长/宽≈2）。这类酵母主要用于酿造葡萄酒等，另外也可用于啤酒生产。第三类的细胞为长圆形（细胞长/宽＞2）。这类酵母比较适应耐高渗透压和高浓度盐的条件，适合以甘蔗糖蜜为原料的酒精生产。

1 菌种的分离纯化与复壮

1.1 菌种的分离纯化

酵母菌在自然界中分布广泛，优良的啤酒酵母可以从不同的陆地或海洋生存环境中有酵母生长繁殖的地方分离筛选得到[8]。酵母和其他微生物一样，易受外界环境的影响而常常导致变异或衰老。为保证产品质量的稳定,需要经常进行酵母菌种的分离纯化。啤酒酵母分离纯化选育是啤酒生产的重要环节。然而引进别人的优良菌种一般转让价格高,企业成本增加，另外微生物还有一个适应企业环境的过程，还须进一步通过实验证明。现在工厂一般采用平板分离培养法从酵母泥中纯化选育酵母菌株。

对啤酒酵母的分离纯化主要有三方面：一是污染了细菌的啤酒酵母的分离纯化。污染有细菌的啤酒酵母，分离方法较为简单，一般只需向分离培养基中加入生长抑制剂（如土霉素），培养出的菌落均为酵母菌。二是同时染有细菌和野生酵母的啤酒酵母的分离纯化。这需结合两种方法，首先加入土霉素抑制细菌的生长，然后对酵母菌落进行性能测试，进一步验证其性状,最后分离得到啤酒酵母菌种。啤酒酵母的分离筛选与纯化是一项比较复杂的工作，若操作不规范或操作失误，可能会导致啤酒酵母变异和啤酒风味改变。三是污染有野生酵母的啤酒酵母的分离纯化。由于污染的野生酵母大部分属酵母属，在菌落形态上与纯培养啤酒酵母相似，在平板上很难区别，通过性能测试试验鉴定，最终得到所需纯种啤酒酵母。

酵母的选育通过性能测定实验包括发酵度、死亡率、凝聚性、死亡温度及小样实验等，通过实验选育出优良健壮的菌株。

1.2 菌种的复壮

复壮是指在菌种已出现衰退时，通过纯种分离及生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出没有衰退的个体，以达到恢复该菌原有特定性状的措施[9]。菌种复壮的方法有：控制少传代法，即当分离纯化得到优良菌种时，经鉴定具备用与生产的良好性能，可以选出其中几支用石蜡保藏起来，以备后用，此法传代的代数减少，可降低群体退化概率,操作简便,效果好；模拟大生产复壮法，贮藏的菌种在使用前大都处于休眠状态,使用时应先进行活化，调整细胞内酶系，使各种原备功能得以复原和复壮；淘汰法，即将衰退菌种进行一定的处理，如进行药物，低温、高温等处理，可以淘汰已衰退个体而达到复壮；遗传育种法，即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出稳定性好不易退化的菌种[10]。

2 物理诱变育种

传统的物理诱变方法主要是紫外诱变和射线等。当前，物理学和其他一些学科技术在生物学研究中广泛渗透,为微生物遗传育种工作开辟了一条新路。这些技术有离子束注入技术、激光诱变育种、高压静电技术、微波诱变和航天技术等。

2.1 紫外诱变

陈叶福等[11]研究了啤酒酵母出发菌株S-5经过紫外诱变，通过初筛和复筛，最终获得一株低产硫化氢的啤酒酵母突变株M8。与出发菌株相比，M8硫化氢生成量大幅下降。通过诱变育种，选育出硫化氢生成量低、同时二氧化硫产量适当提高的啤酒酵母菌株,以增加啤酒的抗氧化能力。申玉香等[12]采用紫外线诱变对APV菌株进行筛选，选出苯黄隆抗性菌株，经实验室菌种分离、筛选及双乙酰驯化等步骤,筛选出一株双乙酰峰值低的酵母菌株,该菌株发酵的成品啤酒双乙酰含量为0.07 mg/L,真正发酵度为65.8%的菌株。通过诱变育种，选育能产特定物质的菌种，并且能进一步缩短发酵时间，降低能耗，降低生产成本。李崎等[13]对一株啤酒酵母进行紫外线诱变筛选抗老化能力的菌株,筛选获得一株A27菌株，经过驯化后分离得到的优选株MI4是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母，能够提高啤酒的风味稳定性。

2.2 离子束注入育种方法

受太空育种等辐射育种的启发，离子束是一种生物品种改良的新技术。在微生物诱变育种的研究中，利用离子注入进行微生物菌种改良已广泛应用。离子束诱变育种与传统方法相比，具有损伤轻，突变率高，突变谱宽，遗传稳定，易于获得理想菌株等特点。离子束注入一方面会引起DNA链断裂，另一方面由于质量、能量、电荷的三因子协同引起大量受体原子移位、重组，形成新的分子结构和基因，产生丰富的基因突变，是较理想的选育菌株的方法。袁仲等[14]采用10 kev低能N+注入啤酒酵母，经筛选获得一株凝聚性强，适合于用小麦汁发酵生产啤酒，该菌株发酵度为66%～68%，双乙酰含量低于口味阈值的菌株。

2.3 激光诱变育种方法

用激光照射酵母菌，可以通过产生光、热、电、压力和电磁效应的综合作用，影响酵母菌使其细胞DNA或RNA改变，酶活改变，进而引起细胞分裂和细胞代谢活动的改变。到目前为止，国内外关于激光诱变微生物已做了大量的研究。激光诱变具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点。

吴英敏等[15]以絮凝性弱而其他发酵指标皆可的啤酒酵母菌Fs为出发菌株，以激光-氯化锂为复合诱变剂诱变啤酒酵母得到一株絮凝性适中的啤酒酵母，絮凝性为37.9%，比原菌株提高了1.61倍。用该菌株酿造的啤酒，发酵液中双乙酰含量为0.048 mg/L，风味指标几乎不变。李建飞等[16]研究了采用新型的离子注入法与氦氖激光技术对啤酒酵母进行复合诱变，选育到了优良啤酒酵母菌株，该菌株与出发菌株相比，发酵能力和还原双乙酞性能强，且遗传稳定性好，在连续多次传代过程中，各项性能指标都正常，可以用于啤酒厂的大规模生产。文章研究采用新型的离子注人法与氦氖激光技术联用对啤酒酵母进行复合诱变，以选育优良的啤酒酵母菌株。

2.4 高压静电育种方法

高静压是采用100 MPa以上静压对物料进行特殊加工的技术。近些年来，静电生物效应的研究十分活跃,尤其在微生物领域得到广泛的应用。高压静电场对生物有机体细胞的影响主要是:引起细胞DNA和染色体畸变、酶活差或钝化、细胞分裂和代谢慢等。研究发现经高压静电场处理的酿酒酵母变异菌株的乙醇脱氢酶同工酶的酶谱发生了不同程度的变化,证实了高压电场对酿酒酵母的诱变作用。这为高压静电场应用于酿酒酵母菌的诱变育种开拓了新的前景。实验采用高静压处理，通过对实验室保藏啤酒酵母菌种SP-3进行诱变处理，发现在250 MPa，保压时间为30 min时，得到一株酵母菌株，酒精度比出发菌珠降低了1.6%vol，并且新菌株凝聚性良好,双乙酰含量较低。高压对微生物有多方面的影响，不仅可使微生物细胞体积、形态、细胞组分发生变化，而且可使微生物的核酸结构及其生物学功能和基因表达发生改变[17]。

2.5 微波诱变育种方法

王勇等[18]以啤酒酵母菌种SY-9作为出发菌株，利用微波诱变技术，进行适量低产SO2啤酒酵母菌株的选育。突变株与原始出发菌株相比，SO2产量明显降低，其遗传物质与出发菌株SY-9相比有较大差异，是一株适量低产SO2的新菌株。潘明等[19]以微波辐射技术对啤酒酵母菌进行诱变，以发酵液中为主要指标筛选获得一株低产双乙酰的优良啤酒酵母菌株，此菌株发酵液中的双乙酰含量比原始菌株降低了36%；其发酵液保持了亲株的优良风味和凝聚性。该菌株经多次传代，双乙酰含量保持了较低的水平。

2.6 航天诱变育种方法

马旭光等[20]对经航天诱变的啤酒酵母菌进行复壮，并对复壮后的酵母菌株从细胞大小、菌落形态、发酵力、增殖情况以及死灭温度等几方面进行了筛选。试验结果表明，诱变后菌株的发酵力、生长速度均优于出发菌株，死灭温度基本相同。并依此筛选出了一株各种生理性状都较好的诱变菌株。研究通过对航天诱变的啤酒酵母菌的复壮和优良菌株的筛选，以期望能广泛利用碳源大量生产SCP提供优良菌株和奠定理论基础。

3 化学诱变育种

化学诱变育种是用特定的化学物质对微生物进行处理，以诱发遗传物质的突变，从而引起变异，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最终育成新品种。常用化学诱变剂主要有：烷化剂、核酸碱基类似物、亚硝酸、叠氮化钠、秋水仙素等。

王勇等[21]采用硫酸二乙酯对啤酒酵母出发菌株SY-8进行化学诱变，通过不同硫源鉴别培养基的反复筛选，得到适量高产SO2的突变菌株MS-10。发酵实验结果显示突变菌株MS-10的SO2生成量与原始出发菌株相比有很大提高，其遗传物质与出发菌株SY-8相比较大差异，是一株适量高产SO2的新菌株。傅力等[22]以啤酒酵母X为出发菌株,用亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）连续诱变,通过初筛及复筛,得到一株产蛋白酶A活力低的啤酒酵母突变株GM235。与出发菌株X相比，GM235发酵的啤酒正丙醇含量高于出发菌株,蛋白酶A活力降低了19.83%，异戊醇和总高级醇分别降低了5.03%和4.87%，降糖能力和双乙酰还原能力略强。陈旭等[23]采用甲基磺酸乙酯（EMS）对啤酒酵母进行化学诱变，利用平板筛选得到五株低产蛋白酶A的菌株。突变株E10在发酵力、风味物质和双乙酰还原能力等综合指标保持了亲株的优良性状，同时蛋白酶A活力显著降低,后代遗传性状稳定。

化学诱变的优点有：使用经济方便，只需少量的药剂和简单的设备；不同化学诱变剂对不同组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。

4 杂交与融合技术的应用

4.1 杂交育种

杂交育种是利用酵母的生活史,并利用其具有不同遗传特性和相反交配型的细胞产生的双倍体这一特点进行的的育种方法。杂交育种可以消除菌株经过长期诱变后所出现的产量性状难以继续提高的困难。Rainnien等[24]用选自乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母为亲本进行杂交,获得的杂合子同时具有两个亲本的优良性状，即具有分解苹果酸能力强和生成乙酸能力弱的特点。Romano等[25]曾将一株絮凝性强酵母与一株不产SO2的酵母杂交获得了一株絮凝性比较强且不产SO2的酵母,并用于生产中。目前采用强迫交配法,用非交配型菌株在高浓度状态下与单倍体菌株交配,也可育成抗嗜杀酵母的啤酒酵母。通过强迫交配法将嗜杀酵母的嗜杀因子导入啤酒酵母的细胞，使啤酒酵母具有嗜杀因子，这样可防止其他酵母菌的污染。杂交后代具有双亲优点，同时还具有优于双亲的性状，杂交种的生活力强、适应性广，有较强的抗逆力和竞争力。

4.2 原生质体融合

原生质体融合技术是指两种不同的亲株经酶法去壁融合得到原生质体，置于高渗溶液中，在一定融合剂的作用下使两者相互凝集并发生细胞融合，进而形成基因重组，获得融合了亲本优良性状的新菌株的育种方法。原生质体融合技术具有杂交频率较高、受接合型或致育型的限制较小、遗传物质更完整，同时融合子集合了参与融合的两株以上亲株的优良性状，对于提高菌株产量和品质有利。

原生质体融合技术,在酵母菌种优良性能的整合方面越来越显示它的优越性。陈海昌等[26]用啤酒酵母和糖化酵母进行原生质体融合,筛选出的融合株既有较高的发酵度和絮凝性，又能水解淀粉和糊精，适宜生产低糖啤酒。有研究表明，把啤酒酵母与糖化酵母进行细胞融合，从中选几株融合子用于发酵，其发酵度高，降糖速度快，具有一定糖化糊精能力。王正祥等[27]运用原生质体融合技术成功地将杀伤质粒转入啤酒酵母中，并使其能十分稳定地表达杀伤性能。经发酵试验证明融合株具有与亲株相似的发酵性能。所生产出的啤酒与亲株相似且能保持较长时间的杀菌力。周东坡等[28]将生产用的两种啤酒酵母分别进行单倍体化。经摇振培养后,酶解制备原生质体,对一株进行紫外灭活,而另一株进行热灭活,再利用PEG进行融合，挑选融合子。经试验证明融合子是一株口味独特、发酵度高、絮凝性强、遗传性能稳定兼具有多种优良性状的啤酒酵母生产新菌株。因此，利用原生质体融合技术构建新型高效啤酒专用酵母将对我国啤酒工业的发展起重大的促进作用。原生质体融合可以提高重组率，是获得胞质杂种的理想途径。体细胞杂交克服远缘杂交不亲和性的障碍，在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。

5 基因工程育种

基因工程是指把某一生物体供体的遗传物质在体外经限制性内切酶与连接酶的“剪接”作用,与一定的载体质粒、噬菌体、病毒等相连接重组，构成重组分子,再导入另一生物体受体细胞中,使外源片段在受体细胞内得到表达,并稳定遗传的技术。利用基因工程手段，从生物体内提取出所要表达的基因或人工合成的DNA片段，导入适当的载体，再转入酿酒酵母细胞中，使遗传物质重新组合，从而实现对酿酒酵母的改良。Drangiris等[29]从S.cerevisae和S.uvarum品系中克隆编码乙醇乙酰转移酶的基因，转导至酵母细胞中，乙醇乙酰转移酶表现出高活性，提高了啤酒中乙酸戊乙酯和乙酸乙酯等产香气物质的生成，啤酒的香味更强烈。啤酒酵母育种的进展与啤酒酵母分子遗传学研究的迅猛发展是分不开的。传统的遗传学方法虽在育种方面取得一定的成绩，但仍有不足之处。现代基因工程技术由于其育种具有定向性，目前已广泛应用于微生物菌种的改造与重组。利用基因工程可以在不改变啤酒酵母原有酿造特性的条件下，赋予啤酒酵母新特性。有研究表明，菌株之间存在着遗传差异，风味也不尽相同，这意味着不同菌株之间存在着特定的等位基因，并且这些等位基因影响着风味物质的产生。对几株菌株进行部分或全部测序的结果表明，与风味物质形成相关的基因存在着遗传差异[30]。因此，基因工程的发展，为赋予啤酒酵母许多优良酿造特性提供了一条捷径，并使定向育种变得切实可行。从理论上看，我们可以利用基因工程技术提高酿酒酵母对各种环境因素的耐受性，可显著提高发酵水平。

6 展望

啤酒因其具有的营养和保健作用而备受现代人推崇，成为当今饮料业的发展方向。在当前啤酒生产中,酵母的选育工作是仅次于生产设备和技术的重要因素。在啤酒发酵过程中要得到双乙酰还原速度快和适量产醇和酯的菌种，都可以通过酵母的选育来实现。因此,为了优化啤酒的生产工艺,提高啤酒的产量和质量,选育优良品质的啤酒酵母是非常必要的。人们越来越注重啤酒的质量、风格和特点。因此，为了适应不同区域、不同品种、不同风格、不同消费需求的啤酒的生产，优良啤酒酵母的选育工作，尤其是特酒特菌的专用啤酒酵母的选育就显得非常必要。

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The Methods of Improving Beer Yeast Performance

QIU Xiu-wen,WU Xiao-yu,GOU Xiao-yan*,WANG Yuan-xiu
(College of Bioscience and Bioengineering of Jiangxi Agriculture University,Nanchang Key Laboratory of Fermentation Application Technology,Nanchang 330045,Jiangxi,China)

2011-11-09

校博士启动基金项目（20081001）；江西省科技支撑项目[2008（212号）]；江西省自然科学基金（2008GJN0016）

邱秀文（1984—），男（汉），硕士研究生，主要从事微生物与发酵工程的研究工作。

*通信作者：郭晓燕，主要从事发酵工艺研究。