家蚕杆状病毒表达系统研究进展

寿 鑫，应慧慧，李 擎，于 威,2，张耀洲,2

(1.浙江理工大学 生命科学学院，杭州 310018；2.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州 310018)

家蚕杆状病毒表达系统研究进展

寿 鑫1，应慧慧1，李 擎1，于 威1,2，张耀洲1,2

(1.浙江理工大学 生命科学学院，杭州 310018；2.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室，杭州 310018)

近年来家蚕杆状病毒表达系统在应用和优化等方面研究有了新进展。家蚕杆状病毒表达系统利用携带外源目的蛋白基因的重组杆状病毒对家蚕及其细胞系的高效感染能力，在感染后的家蚕体内或培养细胞中大量表达目的蛋白。家蚕作为一种外源蛋白表达载体，具有与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰过程，其与核型多角体病毒的动态相互作用也一直是研究的热点。由于该系统潜在的巨大优势，为生产人类急需的蛋白质药物、基因工程疫苗和基因工程杀虫剂等提供了新的途径。

家蚕；杆状病毒表达系统；新进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种具有囊膜的双链环状DNA病毒，其基因组大小介于80～180 kb之间。杆状病毒主要感染无脊椎动物，特别是鳞翅目昆虫，包括膜翅目、双翅目、脉翅目、蚤目、缨尾目、毛翅目等7个目的昆虫。杆状病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)，可分为两个病毒属：核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus, NPV)和颗粒体病毒属(Granulovirus, GV)。

家蚕饲养在中国历史悠久，具有饲养方便、成本低廉的特点，昆虫杆状病毒表达系统具有高效表达、安全性好、真核修饰、可容纳外源基因大等优势，因此，利用杆状病毒在家蚕内高效表达外源蛋白具有产业化应用前景和优势。本文从家蚕杆状病毒表达系统的应用和优化来简述近年来家蚕杆状病毒表达系统的最新研究进展。

1 杆状病毒表达系统的发展

Maeda[1]于1985年利用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus, BmNPV)作为载体表达了人β-干扰素，但是其构建重组病毒的方法存在重组病毒筛选困难、耗时长等问题。Luckow[2]于1993年构建了可以在大肠杆菌中复制并对昆虫细胞仍具有的侵染能力的杆状病毒穿梭载体(Baculovirus shuttle vector, Bacmid)，大大缩短了重组病毒构建所需时间。这种技术根据细菌转座子原理，利用细菌转座子将供体质粒上的表达盒转移至Bacmid基因组上的attTn7位点，从而获得了重组病毒基因组。同时在重组病毒基因组添加了多种抗性基因及LacZ缺失标记，利于重组病毒的筛选及鉴定。

Motohashi[3]于2005年利用相似方法构建了BmNPV bacmid和E.coli DH10B转化细胞，建立了基于家蚕的Bac-to-Bac表达系统。目前已开发数种杆状病毒表达技术，有数百种重组蛋白利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中成功表达。

2 外源基因在家蚕中的表达

家蚕杆状病毒表达系统表达的外源基因来源广泛，其中大部分来自于真核生物，也有一些基因来自于细菌等微生物。家蚕杆状病毒表达系统作为一种真核细胞表达系统，可对表达的蛋白进行修饰如磷酸化、酰基化、糖基化等，其高级结构与天然相似，通过设计信号肽分子，能够增加膜蛋白或分泌型蛋白的表达[4]。

到目前为止，多种外源蛋白基因利用家蚕杆状病毒系统在家蚕中获得了高效表达，广泛涉及医用药物蛋白、疫苗生产等领域。如：类胰岛素样生长因子(IGF-II)[5]、小鼠白细胞介素3(IL-3)[6]、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(HGM-CSF)[7]等基因。同时在家蚕细胞中表达了乙型肝炎表面抗原(HBsAG)疫苗[8]、口蹄疫亚单位疫苗[9]等。

2.1 外源基因的表达方式

目前，外源基因引入家蚕核型多角体病毒载体可分为插入融合表达和插入破坏原始基因两种。常用的外源基因插入位点一般为病毒粒子的蛋白衣壳基因，包括polh基因、p10基因、gp64基因等。GP64是家蚕核型多角体病毒的一种囊膜糖蛋白，当外源蛋白与囊膜蛋白融合表达时，表达的外源蛋白展示在病毒粒子表面，可对外源蛋白进行蛋白质相互作用研究或作为特异性抗原免疫动物产生免疫保护。

2.2 外源基因的表达水平

不同的外源基因利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫或细胞内的表达量有较大的差异。Sasaki等[10]利用杆状病毒表达系统在家蚕中表达人免疫细胞表明受体(KIR2DL1)，使用镍柱亲和层析从家蚕体液中纯化目的蛋白，其产率达到0.2 mg/幼虫。Zhou等[11]利用杆状病毒表达系统在家蚕中表达重组内切β-葡聚糖酶，其表达量在家蚕幼虫中达到了386 mg/幼虫。因此，如何提高外源基因在家蚕中的表达水平是一个关键问题。

3 高效表达系统的构建

3.1 杆状病毒表达载体的选择

随着技术的发展，越来越多的面对不同需求的杆状病毒表达载体已被开发出来。真核细胞表达的大多数蛋白质都是多亚基聚合体，在细胞内执行着重要的功能。但是研究这些多亚基蛋白的结构和功能依赖于通过重组表达技术获得大量的构象正确的蛋白质。MultiBac是一种杆状病毒表达载体系统，目前已被用于真核多亚基蛋白复合物的生产。MultiBac系统是在Bac-to-Bac的基础上通过改造转移载体(Transfer vector)和Bacmid，利用Tn7转座受体位点将转移载体上的目的基因转入病毒基因组上，获得重组病毒[12]。Yao等[13]利用三种供体载体和DAP营养缺陷型大肠杆菌受体，构建了能同时表达轮状病毒vp2、vp6、vp7基因的重组BmNPV，在家蚕幼虫中实现了轮状样病毒颗粒的组装。这种方法为在真核细胞中高效表达多蛋白复合体提供了可能。

细菌辅助交配遗传整合型克隆方法(Matingassisted genetically integrated cloning, Magic)是一种体内高效克隆目的基因的方法，通过细菌接合、体内特异性位点限制性剪切和同源重组技术使目的DNA片段从供体质粒转移到受体质粒，获得重组Bacmid分子[14]。Yao等[15]将承载了目的DNA的pCT dual供体质粒的菌株和含有经过修饰的Bacmid的受体菌株混合，在体内的限制性内切酶和DNA连接酶作用下，利用同源重组获得重组Bacmid DNA，将Bacmid DNA/CaPO4混合物注射入家蚕幼虫体内获得重组病毒。这种方法可将构建重组Bacmid DNA时间缩短到三天，且可利用磷酸钙法转染细胞，降低了生产成本。

3.2 启动子的选择

启动子一般分为极早期启动子、早期启动子、晚期启动子，以及极晚期启动子。杆状病毒载体一般使用polh启动子或p10启动子，这些强启动子属于极晚期启动子，可以在感染晚期大量高效地表达，但同时也会引起蛋白聚集。polh基因是病毒复制的非必需基因，编码多角体蛋白，插入失活后可以产生明显的表型变化，可作为一种重组病毒的筛选标记。P10蛋白与多角体蛋白一起参与包裹病毒粒子和多角体形成。由于p10基因缺失时不能产生可识别的表型差异，可引入LacZ作为筛选标记筛选重组病毒。

根据目前的研究，BES中多角体启动子控制下外源基因的表达水平通常远不如多角体蛋白的表达水平。因此，在多角体基因序列后面插入外源基因，融合表达可使外源蛋白的表达量增加。Lee等[16]将猪瘟病毒CSFV的包膜蛋白E2与核型多角体病毒的多角体蛋白融合表达，在家蚕血淋巴和家蚕幼体中表达量分别达到0.68 mg/mL和0.53 mg/幼虫，免疫试验和病毒中和试验表明，融合蛋白具有免疫原性和显著的病毒中和活性，可用于大规模生产的猪瘟病毒E2抗原。

为了减少蛋白的聚集，可以选用在感染时较早表达的、核衣壳蛋基因启动子，如vp39启动子。核衣壳蛋白基因vp39是一个杆状病毒在晚期表达的必需基因，其表达产物vp39蛋白是组成病毒核衣壳的主要成分。但是vp39启动子在减少蛋白降解的同时也会降低蛋白的表达量[17]。

3.3 宿主的选择

一般来说，家蚕幼体表达重组蛋白的水平要高于细胞。另外，蚕蛹也可以被用来作为生物反应器生产蛋白质。Ishikiriyama等[18]对比了半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶缺陷型的BmNPV bacmid与未修饰的bacmid在蚕蛹中表达scFv的差异，发现差异很小。这可能是因为半胱氨酸蛋白酶在蚕蛹中表达量比较少，因此，利用蚕蛹来生产半胱氨酸蛋白酶敏感型蛋白或许是个不错的选择。研究表明，家蚕幼体具有丰富的血淋巴而适合于分泌型蛋白的表达，蚕蛹则更适合表达膜蛋白和内在蛋白[17]。

由于绝大多数重组杆状病毒都采用替换多角体基因(polh)，导致病毒无法形成包涵体颗粒，给接种家蚕带来了一定的困难，因此建立一种在家蚕体内简单、快速生产重组蛋白的方法显得尤为重要。Lee等[19]将家蚕核型多角体病毒基因组、转移载体和脂质体共同注射到5龄家蚕中，从血淋巴中获得了重组病毒。再将含有重组病毒的血淋巴接种到5龄家蚕内，检测发现外源蛋白在家蚕体内高效表达。

Wang等[20]发现荧光增白剂可以提高缺少了多角体基因的重组BmNPV对家蚕的经口感染率，他们将重组病毒粒子与荧光增白剂VBL混合添加入家蚕人工饲料，喂食家蚕后发现最大感染率达到90 %，并且与对照组相比，试验组家蚕蛋白酶含量和肠液pH值均减小，病毒感染率的提高或由虫体消化系统的异常生理变化导致。

3.4 杆状病毒基因组的改造

在家蚕细胞中表达的蛋白容易被降解，其原因与半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶有关。几丁质酶是一类具有生物催化活性的水解蛋白酶，可降解昆虫体内几丁质，使虫体液化，激活了半胱氨酸蛋白酶的释放，从而使表达蛋白被降解[21-22]。Park等[23]发现转染了BmNPV-CP−bacmid的家蚕与对照相比血淋巴中蛋白酶活性减少了85 %。目前已利用缺失半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶的家蚕核型多角体病毒高效表达了人IgG1[24]、纤维素酶[25]等。因此，通过修饰杆状病毒基因组，将导致重组蛋白降解的蛋白酶基因敲除，从而减少重组蛋白被分解，就可以提高目的基因的表达水平。

4 糖基化修饰

蛋白质糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰，参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程。蛋白质的糖基化，特别是N-连接糖基化主要发生在膜蛋白、分泌蛋白等上，具有重要的生物学意义。Katsuma等[26]利用定点突变技术使得从BmN细胞中表达的成纤维细胞生长因子(FGF)缺少N-葡聚糖结构，发现目的蛋白被完全抑制分泌进入培养基。这表明N-葡聚糖结构在杆状病毒编码蛋白分泌过程中具有重要作用。

但是家蚕和人的糖基化修饰方式具有明显的不同，昆虫细胞表达的糖蛋白是简单的寡甘露糖N-糖链构型，而哺乳动物的糖蛋白是具有唾液酸末端的杂合型N-糖链构型。这种差异与昆虫细胞内存在一种特殊的N-糖基加工的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶有关[27]。因此，对昆虫杆状病毒表达系统的糖基化修饰途径进行改造，将更有利于人源化糖蛋白的合成。

Dojima等[28]研究发现，分子伴侣的存在可以增加人分泌型IgG1蛋白在家蚕幼虫内的表达量，且其 N-葡聚糖的结构没有改变。这表明虽然分子伴侣可辅助蛋白的翻译后修饰过程，但其 N-糖基化修饰是由高尔基体控制的。因此，如果通过共表达N-乙酰葡糖氨基转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶能够改进糖基化途径， 将有助于人源化抗体的生产[28]。

5 核型多角体病毒与宿主细胞的相互作用

杆状病毒与宿主细胞的相互作用是一种自然进化和相互适应的过程，包括宿主对杆状病毒的作用和杆状病毒对宿主的影响。目前，在病毒或家蚕的基因发现、功能研究上较为热门，而对两者在分子水平上的相互作用研究较少。

杆状病毒的基因表达具有时序性，在病毒侵染的初始阶段，早期基因的表达可帮助病毒建立感染和选择性的作用于宿主的特异基因，以利于控制宿主基因表达和子代生产。晚期转录时相主要为病毒粒子DNA的复制和结构基因表达。正如大肠杆菌会丢失转入的质粒一样，宿主细胞对病毒的侵染会出现抵制行为，如免疫反应、凋亡、RNA干扰等策略。

Sagisaka等[29]发现经BmNPV侵染家蚕细胞12 h后，利用寡核苷酸微点阵检测宿主基因的转录情况，宿主基因中有35个出现了明显的上调，17个基因出现下调现象；利用定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测家蚕细胞中mRNA表达水平发现，13个基因有显著的上调、7个基因出现了下调现象，但是大多数基因的表达水平并没有发生较大变化。说明杆状病毒的侵染会对宿主细胞的基因表达产生影响，进而影响宿主细胞的正常生理活动。

泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome pathway)主要参与体内蛋白质的识别和降解过程，在家蚕核型多角体病毒逃避宿主细胞的免疫监视、病毒粒子的释放具有重要作用。Xue等[30]检测发现在病毒感染过程中泛素-蛋白酶体通路相关基因出现上调现象，并且病毒表达蛋白与多种宿主蛋白发生了相互作用，其中的5种病毒表达蛋白参与了基因的转录过程，暗示泛素-蛋白酶体通路与病毒侵染过程相关。Katsuma等[31]利用特异性蛋白酶抑制剂MG-132处理用BmNPV侵染的BmN-4细胞，发现病毒粒子出芽和多角体蛋白合成减少，暗示蛋白酶体降解病毒自身蛋白或者宿主细胞蛋白对于感染早期多角体基因的高效表达是必须的。另外，在BmNPV中敲除病毒泛素基因(v-ubi)后，病毒侵染不能形成出芽型病毒和合成多角体蛋白，进一步说明泛素-蛋白酶体系统在病毒侵染过程中的重要性。

6 家蚕杆状病毒表达系统的展望

家蚕作为一种特殊的经济昆虫，与其他表达载体相比更具优越性。利用家蚕表达外源重组蛋白具有成本低廉、操作方便、生产高效和适合产业规模化生产的优点，家蚕杆状病毒表达系统在农业、基础分子生物学，以及医学领域具有极其重要的应用价值。

尽管杆状病毒表达系统有着一系列的优点，但也存在不足。首先，用外源基因替代多角体蛋白后，目的蛋白的表达水平差异较大，如何提高表达量，建立一个高效的、稳定的合适表达载体仍是一个重要的研究内容。其次，蛋白糖基化修饰方式与哺乳动物细胞存在一定差异，不能满足人源化蛋白表达的要求。并且由于外源基因是通过最终杀死细胞的病毒载体导入宿主细胞的，所以杆状病毒表达系统不能提供稳定的细胞株。

目前，家蚕和杆状病毒的基因发现和单个基因的功能研究已有较多报道，但是对于家蚕和杆状病毒间的动态相互作用却研究较少。因此，对家蚕和杆状病毒进行深入的功能基因组学研究，不断改造和优化这一表达系统，来生产高附加值的药用蛋白和疫苗，将具有广阔的应用前景和极大的竞争优势。

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Progress of researches on baculovirus expression system of bombyx mori

SHOU Xin1, YING Hui-hui1, LI Qing1, YU Wei1,2, ZHAGN Yao-zhou1,2
(1.College of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Silkworm Bioreactor and Biomedicine, Hangzhou 310018, China)

Based on application and optimization of baculovirus expression system of bombyx mori, this thesis summarizes the progress of latest researches on baculovirus expression system of bombyx mori. The expression system of bombyx mori baculovirus uses the high-efficiency infectivity of recombinant rhabdovirus carrying exogenous objective protein gene production on its cell lines to express a large number of objective proteins in infected bombyx mori or cultivated cells. As an expression vector of exogenous protein, bombyx mori has post-translational modifications like the mammalian cells and the dynamic interaction with Bombyx mori nucleopolyhedrovirus has been a hot research field all the time. As the system has potential huge advantages, it provides new approaches for protein medicine, genetic engineering vaccine and genetic engineering insecticide which people need urgently.

Bombyx mori; Baculovirus expression system; New progress

S881.24

A

1001-7003(2012)09-0018-05

2012-06-07

国家高技术研究发展计划“863”项目(2011AA10 0603)；浙江省自然科学基金项目(Y3090339)；浙江省大学生科技创新计划项目(2011R406028)

寿鑫(1990－ )，男，2009级生物技术专业本科生。通讯作者：于威，副教授，硕导，yuwei@zstu.edu.cn。