D2-40在肿瘤淋巴管标记研究应用新进展

唐 振（综述）禹正杨（审校）

（南华大学附属第一医院肿瘤外科，湖南 衡阳421001）

目前恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病，然而治疗恶性肿瘤的难点就是肿瘤的复发和转移，血道及淋巴道转移是恶性肿瘤最主要的转移途径和复发的根源[1]。因此恶性肿瘤的血道和淋巴道转移与患者的预后密切相关。目前对各种肿瘤的生物学行为的研究也常涉及肿瘤淋巴管、血管生成及其与肿瘤转移的关系。尽管早在1863年Krause等发现肿瘤内存在新生的淋巴管，但人类对淋巴系统的研究远没有血管系统研究的深入，造成这种现象的主要原因是缺乏有效的鉴定淋巴管的特异性的标志物[2]。由于常规HE染色中，区别淋巴管和血管非常困难，不可避免地存在主观性，找到一种特异性和敏感性都高的淋巴管标志物，对恶性肿瘤组织中淋巴管和血管的研究显得尤为重要。

近来区分淋巴管和血管的方法取得了积极进展，一些淋巴管内皮细胞的特异标志物被陆续发现，如酶组织化学染色5’核苷酸酶（5’Nase）、血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）、淋巴管内皮透明质酸受体-1（ LYVE-1）和肾小球足突细胞黏蛋白（ Podoplanin）、D2-40等，但标记淋巴管的5’核苷酸酶以及VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin等抗体都存在许多不足之处。D2-40是新近发现的最特异性、最好的恶性肿瘤淋巴管内皮细胞标志物[3]，其特异性明显高于目前常用的淋巴管标志物VEGFR-3等[4]。

目前对D2-40的研究是淋巴管标志物领域的一个新的研究热点，D2-40对研究恶性肿瘤的淋巴管生成机制、淋巴管浸润扩散以及通过靶向治疗抑制肿瘤淋巴道转移等有着积极意义。本人就D2-40在病理诊断中的应用进展作相关综述。

D2-40的结构特征及重要生理功能：D2-40分子是Marks等[5]于1999年在研究生殖细胞肿瘤和胚胎睾丸的精母细胞表面新发现的一种唾液酸粘蛋白，其mRNA翻译的蛋白质分子由 166个氨基酸构成，质量为43kD，是最新发现特异性标记淋巴管的鼠来源IgG1单克隆抗体。最近国外通过在人类淋巴管内皮细胞上进行Western blotting、ELISA及siRNA介导的podoplanin基因敲除等方法，发现D2-40抗体能通过唾液酸蛋白特异性结合、检测肿瘤淋巴管内皮上固定的抗原决定簇，即跨膜糖蛋白podoplanin FC片断，其敏感度和特异性均都高于其他淋巴管内皮的分子标志物[6]。

最新的研究发现D2-40可用来标识多种肿瘤的新生微淋巴管内皮上有固定的抗原决定簇，该抗原决定簇在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和血管内皮上没有表达[7]。甄乐锋[4]等用D2-40进行免疫组化染色标记组织淋巴管时发现其仅在被覆单层内皮细胞的小淋巴管如终末淋巴管显色，它既不能使有周细胞/平滑肌的大淋巴管显色，也不能使淋巴结内的高内皮静脉显色。D2-40还可在淋巴结的淋巴窦周壁细胞膜上以及淋巴管内皮细胞间隙表达[8]。超微结构研究也表明D2-40主要表达于淋巴管内皮细胞的腔面，少部分表达于非腔面和细胞间质[6]。

研究发现D2-40作为淋巴管标志物，不仅能是应用于冷冻切片，且能较好地应用于经福尔马林处理后石蜡包埋的组织切片，其使用方法更简便，使用范围也更广泛[9]。D2- 40免疫组化染色判断淋巴管浸润的阳性率明显高于HE染色，并可以避免由于标本固定导致组织收缩而造成的假性淋巴管浸润。D2-40与血管特异性标志物CD31、CD34等在恶性肿瘤中的双重免疫组织化学染色中无交叉反应，可以用于肿瘤血管、淋巴管内皮同时染色[10-12]。

目前常见的几种淋巴管标志物及其特点：最初采用酶组织化学染色法鉴别淋巴管和血管，5’核苷酸酶碱性磷酸酶（5’Nase-Aplases）双重染色法。 5’-Nase染色很容易受实验条件的影响及各种酶之间交叉反应的存在，染色后背景较深， 而且只适用于新鲜标本。最近有报道Alpase也可在淋巴管内皮细胞表达。该法在淋巴管内皮染色中的应用受到一定的限制。

VEGFR-3是第一个被发现的淋巴管内皮标志物，VEGFR-3属于酪氨酸激酶受体家族，它也是最先发现的淋巴管特异性调控受体，主要表达于淋巴管内皮细胞的腔膜面[13]。除表达于淋巴管内皮细胞，其也表达于某些新生血管内皮，所以单独应用VEGFR-3鉴别淋巴管和血管的特异性不高。

LYVE-1是第一个发现的对淋巴管特异的透明质酸受体，是CD44糖蛋白的同系化合物，其均匀分布于淋巴管内皮细胞的基底面和胞膜管腔面。研究表明其特异地表达于淋巴管内皮细胞，也在肝、脾窦隙状血管和胎盘合体滋养层有表达。最近研究显示肿瘤内约有10%的LYVE-l阳性脉管是血管[14]。

另一个淋巴管内皮特异标志物是Porx-1，其是同源异型盒转录因子基因产物，与胚胎淋巴管芽的生长、延伸及淋巴管内皮细胞的表型改变密切相关，是淋巴管生成过程中起调节作用。 Por-x1在内皮细胞中仅特异性地表达于淋巴管内皮细胞，但还可表达于多种类型的非内皮细胞，Prox-1尚还不能独立标记淋巴管内皮，须与 LYVE-1等联合使用才可确定淋巴管特异性。

肾小球足突细胞黏蛋白（podoplanin）是目前一种新的淋巴管内皮特异标志物。目前除了在皮肤某些血管内皮发现其表达外，尚未见其表达于其他组织微血管的报道。虽然podoplanin非常广泛地用作淋巴内皮细胞和淋巴管生成的特异性标志物，但是与D2-40比较，后者有如下优越性：①D2-40是单克隆抗体，而podoplanin 是多克隆抗体；②D2-40不需要特殊处理，可以直接使用，而podoplanin需要作前期亲和力纯化而使用硝基纤维素分解封闭重组体蛋白; ③在进行免疫组化过程中，D2-40石蜡组织切片不需要热修复抗原决定簇，而podoplanin需要进行热修复。另外还有学者认为D2-40与podoplanin抗体相比，有更高的敏感性，而其特异性可高达98.8%[15]。D2-40抗体还能特异性地识别podoplanin。

D2-40在临床病理中的应用：D2-40在许多正常细胞表面也有表达，如淋巴管内皮细胞、间皮细胞、消化道cajal细胞、肌上皮细胞、基底细胞；D2-40在某些肿瘤中也呈阳性表达，包括肌成纤维细胞瘤、胃肠道间质瘤、间皮瘤、精原细胞瘤、某些脑肿瘤（颅咽管瘤，脑脊膜瘤等）等[16]。D2-40在人乳腺、胃、结肠、黑色素瘤、前列腺的癌细胞上则没有表达[3]。D2-40可用于识别正常组织和乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、前列腺癌等多种恶性肿瘤的新生微淋巴管，检测原发肿瘤淋巴管密度、淋巴管浸润以及淋巴道转移。D2-40对肿瘤诊断和鉴别诊断以及判断恶性肿瘤转移进展、预后具有重要意义，已开始广泛应用于肿瘤淋巴管与肿瘤生物学行为关系的研究。

文献报道D2-40在胃癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、口腔癌等肿瘤中D2-40表达与肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、浸润深度、远处器官转移、PTNM分期密切相关，与患者性别、年龄无关。肿块越大、有淋巴结转移、分化程度越低、浸润深度越深、转移器官越多、PTNM分期越晚，淋巴管密度越大[17-18]。D2-40标记的恶性肿瘤淋巴管具有异质性，表现为不同区域的淋巴管管腔形状大小不一和淋巴管密度不均。癌组织周边区淋巴管数量明显增多，淋巴管呈扩张状不规则形，癌组织中淋巴管主要位于癌组织周边区，淋巴管丰富，扩张与闭锁的淋巴管并存，以扩张的为主，且管壁很薄，内皮细胞间有较宽的缝隙，而在肿瘤中心区淋巴管数量较肿瘤周围明显减少，淋巴管多呈闭塞条索状。癌组织周边的淋巴管的异常可能与肿瘤具有侵袭倾向高、分化程度较差及易发生淋巴结转移等恶性生物学特征有关。

D2-40标记淋巴管测定淋巴管密度，可以作为评估肿瘤良恶性及转移状况的一项辅助指标，具有良好的临床病理应用价值，为确定临床治疗方案提供实验和理论依据。D2-40标记的乳腺淋巴管时乳腺良性病变及乳腺癌组织均可见 D2-40的表达，但微淋巴管密度在乳腺浸润性导管癌组明显高于乳腺良性病变组，可能为判断乳腺病变良恶性的指标[19]。Pearson相关性分析显示乳腺浸润性导管癌中微淋巴管密度与淋巴结转移、pTNM分期呈正相关[20]，而与ER、PR 、Her-2表达无关[4]。D2-40标记的微淋巴管密度在宫颈鳞癌中的表达明显高于正常宫颈组织及CIN组织， 且D2-40能够比较客观的反应早期宫颈鳞癌和癌前病变中的淋巴管新生情况[14]。Longatto-Filho[21]研究发现宫颈癌的淋巴管新生始于癌前病变。淋巴管密度也能成为判断子宫内膜腺癌早期淋巴管转移的一个指标[22]。保丽玲[8]等对胃癌中淋巴管密度的检测时，经 D2-40染色证实的肿瘤淋巴管浸润与临床病理参数间的关系进行分析显示，其与胃癌淋巴结转移、Lauren分型和Ming分型密切相关。淋巴管浸润检测还可为早期癌症的手术方式提供参考，即D2-40染色呈淋巴管浸润阴性，可避免对这些患者行根治性手术[23]。此外，D2-40标记间皮细胞的特异度较高，可用于恶性间皮瘤与转移性腺癌浆膜腔积液的鉴别[24]。D2-40还是乳腺肌上皮细胞的一个新的标志物[25]。

肿瘤细胞侵袭淋巴管形成淋巴道转移程是一系列复杂的生物学过程，其间有多个癌基因激活、大量的细胞因子及分子通路的介导，目前的许多机制都处于探索阶段。目前所知癌细胞经淋巴道转移过程中淋巴管生成是肿瘤淋巴道转移的重要步骤。恶性肿瘤细胞，尤其是分化较差及浸润程度较高的恶性肿瘤细胞对周围组织具有较强的扩散、转移能力，容易发生淋巴道转移。

D2-40在判断肿瘤淋巴管分布和肿瘤转移方面具重要作用，但在恶性肿瘤淋巴管生物学行为的研究中，我们必须认识到目前各种淋巴管标志物仅具有相对的特异性。目前对肿瘤淋巴管的认识还在不断完善中，随着淋巴管内皮细胞体外培养技术、转基因技术的提高，以及微转移检测技术的发展，更特异、更灵敏的新生淋巴管检测标记的发现，恶性肿瘤淋巴管生成、淋巴道转移的机制必将得到进一步阐明，将有助于进一步了淋巴管在肿瘤生物学中的作用，并为恶性肿瘤在淋巴管生成、淋巴道转移过程的靶向治疗另辟蹊径。

[1]Ni Y,Wang H,Chen F.Tumor models and speci fi c contrast agents for small animal imaging in oncology[J].Methods,2009,48(2):1252-1381.

[2]Cunnick GH,Jiang WG,Douglas Jones T,et al.Lymphangiogenesis and lymph node metastasis in breast cancer[J].Mol Cancer,2008,7(1):23.

[3]Saad R S,Kordunsky L,Liu Y L,et al.Lymphatic microvessel density as prognostic marker in colorectal cancer[J].Mod Pathol,2006,19(10):1317-1323.

[4]甄乐锋,叶长生,刘民锋,等.D2-40和CD34在乳腺浸润性导管癌中的表达及其意义[J].南方医科大学学报,2010,30(7):1548-1551

[5]Marks A.Characterization and distribution of an oncofetal antigen(M2A antigen)expressed on testicular germ cell tumours[J].Br J Cancer,1999,80(4):569-578.

[6]Schacht V,Dadras SS,Johnson LA,et al.Upregulation of the lymphatic marker podoplanin,amucintype transmembrane glycoprotein,in human squamous cell carcinomas and germ cell tumors[J].Am J Pathol,2005,166(3):913-921.

[7]Yonemura Y,Endou Y,Tabachi K,et al.Evaluation of lymphatic invasion in primary gastric cancer by a new monoclonal antibody,D2-40[J].Hum Pathol,2006,37(9):1193-1199.

[8]保丽玲,王莹,王国英,等.胃癌中D2-40标记的淋巴管密度的检测及表达意义[J].昆明医学院学报,2010,31(12):41-44.

[9]孙薇,周晓军,刘晓红,等.D2-40在原发性胃腺癌淋巴管浸润中的标记及临床病理意义[J].临床与实验病理学杂志,2007,23(6):653-656.

[10]周航波,鲁波,马恒辉,等.CD34与D2-40双重免疫组织化学染色技术在鉴别血管与淋巴管中的应用[J].中华病理杂志,2007,36(5):342-343.

[11]谢晓冬,屈淑贤,郑振东,等.人乳腺癌中D2-40标记的微淋巴管密度与淋巴结转移关系的研究[J].中国肿瘤临床,2008,35(14):810-813.

[12]Afonso J,Santos LL,Amaro T,et al.The aggressiveness of urothelial carcinoma depends to a large extent on lymphovascular invasion_the prognostic contribution of related molecular markers[J].Histop athology,2009,55(5):514-524.

[13]Morelli MP,Brown AM,Pitts TM,et al.Targeting vascular endothelial growth factor receptor-1 and-3 with cediranib(AZD2171):effects on migration and invasion of gastrointestinal cancer cell lines[J].Mol Cancer Ther,2009,8(9):2546-2558.

[14]杨守华,程恒辉,王泽华.LYVE-1和 D2-40 在检测早期宫颈鳞状细胞癌和癌前病变微淋巴管中的研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2008,17(6):588-593.

[15]陈颖,石园,孙路得,等.D2-40在转移性癌及间皮细胞浆膜腔积液中的表达[J].中国癌症杂志,2007,17(7):536-538.

[16]Nakamura Y,K anemura Y,Yamada T,et al.D2-40 antibody immunoreactivity in developing human brain,brain tumors and cultured neuralcells [J].Mod Pathol,2006,19(7):974-985.

[17]陈萍,张玉华,韩影,等.D2-40在乳腺癌中的表达及临床意义明[J].临床与实验病理学杂志,2010, 26(1):101-102.

[18]李英,张冬娅.D2-40在结直肠腺癌中的表达及临床意义[J].山西医科大学学报,2009, 40(8):696-699.

[19]黄江生,杨竹林.乳腺良恶性病变组织中TP表达和淋巴管计数及其意义[J].中国现代医学杂志,2006,16(15):2269-2276.

[20]丁贵坡,叶长生,刘民锋,等.D2-40标记的乳腺癌淋巴管浸润与淋巴结转移的关系[J].南方医科大学学报,2010,30(10):2301-2303.

[21]Longatto-Filho A,Pinheiro C,Pereira SM,et al.Lymphatic vessel density and epithelial D2-40 immunoreactivity in preinvasive and invasive lesions of the uterine cervix[J].Gynecol Oncol,2007,107(1):45-51.

[22]沈庆,兰四友,蒋幼凡.IGF-1R、VEGF-C、D2-40 的表达及其与子宫内膜腺癌淋巴结转移的关系[J].山东医药,2011,51(4):96-98.

[23]Ishi IM,Ota M,Saito S,et al.lymphatic vessel invasion detected by monoclonal antibody D2-40 as apredictor of lymph node metastasis in T1 colorectal cancer[J].Int J Colorectal Dis,2009,24(9):1069-1074.

[24]Padgett DM,Cathro HP,Wick MR,et al.Podoplanin is a better immunohistochemical marker for sarcomatoid mesothelioma than calretinin[J].Am J Surg Pathol,2008,32(1):123-127.

[25]El-Gohary YM,Metwally G,Saad RS,et al.Prognostic signi fi cance of intratumoral and peritumoral lymphatic density and blood vesseldensity in invasive breast carcinoma[J].Am J Clin Pathol,2008,129(4):578-586.