灵芪胶囊对S180荷瘤小鼠组织形态学改变的影响

2012-08-11李环苏云明

中医药信息 2012年5期

关键词：内质网切片线粒体

李环，苏云明

(黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040)

肺癌是严重危害人类健康的疾病之一，具有高死亡率，高致残率的特点。目前肺癌的治疗并未取得理想的效果。而中药及复方有效地补充了常规治疗的缺陷［1－2］。灵芪胶囊是一种中药复方制剂，具有很好的抗癌作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，由黑龙江省药物安全性评价中心提供，符合实验要求，体质量(22±2)g，雌雄各半，合格证号:黑动字第P00101006号。

1.2 实验瘤株

小鼠实体型移植肉瘤180(S180)，由哈尔滨医科大学第三附属医院肿瘤研究所提供。

1.3 药物

灵芪胶囊(灵芝、黄芪、绵马贯众、重楼、山慈菇、人参、山药、枸杞、五味子、茯苓组成，由黑龙江中医药大学药理教研室提供。每粒胶囊含生药约1.65g，实验时临时配制成溶液);复方环磷酰胺片(天津金世制药有限公司，国药准字H12021006)。

1.4 主要实验仪器

超净工作台;电子天平;真彩色病理图像分析系统;微量加样器;轮转式组织切片机等。

2 实验方法

2.1 实验分组及给药

造模成功之后，将实验动物随机分为6组，每组10只，实验分组及其给药剂量如下:灵芪胶囊高剂量组(5.00g/kg)，灵芪胶囊中剂量组(2.50g/kg)，灵芪胶囊低剂量组(1.25g/kg)，灵芪胶囊中剂量+复方环磷酰胺组，模型对照组(同等容积0.9%Nacl)，阳性对照组给予复方环磷酰胺片(39mg/kg)。于接种瘤株24h后分组，为灌胃给药，给药时间为连续21天。

2.2 电镜观察瘤组织的组织形态学

超净操作台内抽取传代7f、生长状态良好的S180荷瘤小鼠的腹腔积液，在冰盘上进行操作，以无菌生理盐水按照1∶3的比例进行稀释，按体积0.2ml/只接种实验动物右前肢腋部皮下，注射前先行常规消毒。24h后给药，给药时间为连续11天，停药后，第二天称取小鼠体重，然后处死实验动物，手术取出取瘤块，进行固定。

取材与固定:将正常生长的瘤块打碎成为组织匀浆液，用PBS缓冲液洗涤3次，最后一次将细胞转移到1.5ml的 EP管中，在低温高速离心机中离心，12 000rpm，－4℃，5min，去除上清液，立即转入固定液(2%戊二醛液均可)pH值7.2，4℃固定时间约4h。

倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15min;用1%的锇酸溶液固定样品1～2h;倒掉固定液，用0.1M，pH值7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15min;应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。

丙酮梯度脱水:脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。丙酮梯度脱水浓度配比见表1。

表1 丙酮梯度脱水浓度配比

脱水过程中应注意:逐级脱水而不能急剧脱水;更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡;脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在4℃保存。

包埋与渗透:渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。

把细胞块放入包埋模具的顶端，再放入实验标签，然后加入包埋剂。包埋剂配制及使用过程中的注意事项:所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的;配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂;配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在－10℃ ～－20℃冰箱中，延长其使用期。

聚合:37℃烘箱内过夜，45℃烘箱内12h，60℃烘箱内24h。

标本的修整:将细胞块从温箱中取出，用修块机修整，曝露细胞，在用修块机或刀把曝露出的细胞团修整成45°角立体梯形。

半薄切片的制备:把包埋后修整好的细胞团，切成厚度 0.5 ～1.0μm，最大切片面积 2mm2，目的是补充光镜下所观察的内容，定位制备超薄切片。

超薄切片的定位:超薄切片的面积为0.55mm2，因此在进行超薄切片前必须将细胞团细切，尽量保留所要观察的部位，但保留的部位不能太大，否则影响切片质量。

载网:将切片附在金属载网膜面上。

2.3 醋酸铀－枸橼酸铅双染色电子染色法是利用重金属于细胞的密歇成分结合或吸附，在电子束的照射下，样品形成不同的散射能力，而提高了图像的反差。

3 结果见图1。

图1 电镜观察瘤组织的组织形态学图片(11 500×)

空白对照组:细胞多呈现圆形，表面有大小不等的突起和长短不一的绒毛，核形不规则，核仁清晰。胞浆双层膜结构清晰，可见线粒体，粗面内质网，游离核糖体。核膜轻度生理性皱缩，细胞表面可见微绒毛和较大突起。

灵芪胶囊高剂量组:部分细胞胞浆空泡变性，部分细胞固缩坏死。胞浆内可见大小不等的空泡状结构，线粒体髓样变性，粗面内质网明显减少，双层膜结构不清晰。粗面内质网脱颗粒。细胞膜破损，细胞核肿胀，异染色质边集，线粒体空泡变性，大部分线粒体肿胀。细胞器结构模糊，核膜不清晰，细胞膜破损。

灵芪胶囊中剂量组:大部分细胞崩解坏死，异染色质边集，细胞体成凋零状。胞浆内可见大量的自噬体，细胞膜不清晰，内质网，游离核糖体明显减少。部分线粒体肿胀，部分线粒体嵴融合，粗面内质网脱颗粒，游离核糖体减少。细胞器结构模糊。细胞形态不规则，细胞突起明显减少，细胞膜不完整，细胞器膜性结构融合。部分细胞细胞器结构消失，胞浆内残存少量游离核糖体。

灵芪胶囊低剂量组:细胞膜，核膜清晰，突起，微绒毛明显减少。粗面内质网扩张，脱颗粒，可见自噬体。核膜结构清晰，线粒体明显肿胀，核糖体减少。

阳性对照组:部分细胞崩解坏死，部分细胞核异染色质边集，核膜结构不清。核膜结构清晰，可见线粒体结构完整，粗面内质网，游离核糖体。双层膜结构清晰，线粒体丰富，有大量粗面内质网，游离核糖体。细胞多呈圆形，核膜曲度变大，核仁清晰。核膜结构清晰，线粒体膜完整，线粒体结构尚正常。自噬体，为用药导致细胞器损伤。部分细胞浆内可见大小不等的空泡。核膜双层膜结构消失融合，线粒体空泡变性，部分细胞凋零样变性。