响应面法优化超声波提取山核桃壳色素工艺

孙海涛 邵信儒

(通化师范学院，通化，134000)

色素是现代食品工业不可缺少的食品添加剂之一。目前所用的色素多为人工合成色素，虽然色泽鲜艳、着色性好、稳定性好，但本身无任何营养价值，有的甚至有潜在的致癌作用或其他毒副作用，因此合成色素的安全问题越来越受人们关注［1-2］。天然色素不仅安全性高，使食品颜色更接近新鲜食品自然的色泽，而且有些色素还具有营养价值和医疗保健作用［3］。随着人们崇尚天然、追求健康的意识增强，开发天然色素将成为必然趋势。

长白山野生山核桃，又称小胡桃，生长在气候优越、土壤肥沃、植被茂盛的长白山区，每年白露前后成熟。其果仁是一种健康味美、营养丰富的天然绿色食品，具有润沛强肾、降低血脂、预防冠心病之功效，长期食用具有益寿养颜，抗衰老等作用，孕妇食用对胎儿智力发育有神奇功效。目前关于其壳的研究较少，常因其坚硬且不可食用而为燃料，利用价值极低。国外的研究者主要利用核桃壳制备颗粒活性炭和分子筛［4-5］。若能利用长白山野生山核桃壳提取棕色素，应用于食品加工，可有效提高长白山野生山核桃的附加值。本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法优化超声波提取山核桃壳色素工艺，为长白山野生山核桃壳色素的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山核桃：2010年9月采摘于长白山区;95%乙醇、浓盐酸、氢氧化钠，均为分析纯。

TV-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);KQ-200KDB型高功率数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);YS-08型小型高速粉碎机(北京燕山正德机械设备有限公司);TDL80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂);FA1604A型电子分析天平(上海精天电子仪器有限公司);DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 山核桃壳色素吸收光谱

配制一定体积分数的山核桃壳色素溶液，在250～500 nm波长范围内进行光谱扫描，测定色素的吸收光谱。由图1可看出，山核桃壳色素溶液的吸收光谱在λ=277 nm处有明显吸收峰。因此，可选取λmax=277 nm作为测定山核桃壳色素溶液吸光度的特定波长。

图1 山核桃壳色素提取液的吸收光谱

1.2.2 山核桃壳色素的提取

工艺要点：将已筛选好的山核桃壳清洗干净，烘干，放入高速粉碎机中粉碎，过50目筛，备用。称取一定量的山核桃壳粉末，加入适量的提取剂。按要求在超声波辅助作用下提取，提取液定容至一定刻度，静置过滤，滤液离心(4 000 r/min，10 min)，在277 nm波长处测定吸光度［6］。

1.2.3 单因素试验

本试验中选择液料比、乙醇体积分数、超声功率、超声温度、超声时间作为影响山核桃壳色素提取效果的单因素，在各因素试验中采用如1.2.2所述的方法进行色素的提取，以色素提取液吸光度的变化作为评价指标。

液料比对色素提取效果的影响：在乙醇体积分数为50%，超声功率160 w，超声温度50℃，超声时间60 min，研究液料比分别为5 mL∶1 g、10 mL∶1 g、15 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、25 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、35 mL∶1 g时对山核桃壳色素提取效果的影响。

乙醇体积分数对色素提取效果的影响：在液料比15 mL∶1 g，超声功率160 W，超声温度50℃，超声时间60 min，研究乙醇体积分数分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95% 时对山核桃壳色素提取效果的影响。

超声功率对色素提取效果的影响：在液料比15 mL∶1 g，乙醇体积分数为50%，超声温度50℃，超声时间60 min，研究超声功率分别为 80、100、120、140、160、180、200 W时对山核桃壳色素提取效果的影响。

超声温度对色素提取效果的影响：在液料比15 mL∶1 g，乙醇体积分数为50%，超声功率160 W，超声时间60 min，研究超声温度分别为 30、40、50、60、70、80℃时对山核桃壳色素提取效果的影响。

超声时间对色素提取效果的影响：在液料比15 mL∶1 g，乙醇体积分数为50%，超声温度50℃，超声功率160 W，研究超声时间分别为20、40、60、80、100、120时对山核桃壳色素提取效果的影响。

1.2.4 响应曲面优化试验

在单因素试验的基础上，选取液料比、乙醇体积分数、超声功率为自变量，山核桃壳色素的吸光度为响应值，通过Design Expert 7.1.3软件设计3因素3水平的二次回归分析，预测山核桃壳色素提取的最佳工艺［7］。响应面分析因素与水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对提取效果的影响

液料比是提取过程的一个重要影响因素，从传质速率的角度讲，主要表现在影响固相主体和液相主体之间的浓度差，即传质推动力。经测定，在乙醇体积分数、超声功率、超声温度、超声时间不变条件下，随着液料比的增加，提取液的吸光度逐渐增大;当液料比达到15mL∶1g时，提取液的吸光度为0.649，此时达到最大值;但当液料比超过15 mL∶1 g时，随着液料比的增大，色素的吸光度不断下降。故本研究把液料比10 mL∶1 g～20 mL∶1 g作为响应面法的考查范围。

2.1.2 乙醇体积分数对提取效果的影响

经实验得知，在液料比、超声功率、超声温度、超声时间不变的条件下，乙醇体积分数在10%～50%的范围内，山核桃壳色素吸光度随着乙醇体积分数的增大不断增大，在乙醇体积分数为50%时提取液吸光度达到最大值0.644;当乙醇体积分数超过50%时，山核桃壳色素的吸光度逐渐下降;而当乙醇体积分数超过80%时，吸光度急剧下降。其原因可能是由于乙醇体积分数过大，造成色素分解。故把乙醇体积分数40%～60%作为响应面法的考查范围。

2.1.3 超声功率对色素提取效果的影响

在液料比、乙醇体积分数、超声温度、超声时间不变的条件下，超声功率在80～120 W范围内，随着超声功率的增大，提取液的吸光度明显上升;当超声功率在120～160 W时，吸光度变化趋势不明显，且在超声功率为140 W时，提取液吸光度达到最大值0.698;当超声功率达到180 W以上时，提取液的吸光度下降。这可能是由于超声功率过高，超声波的热效应导致提取溶液温度升高，造成色素不稳定而分解。故本研究把超声功率120～160 W作为响应面法的考查范围。

2.1.4 超声温度对色素提取效果的影响

经测定，在液料比、乙醇体积分数为、超声功率、超声时间不变的条件下，随超声温度的升高，山核桃壳色素吸光值呈逐渐升高的趋势，并在超声温度为60℃时，提取液吸光度值达到最大值0.636，此时山核桃壳色素溶出最多。这说明在超声条件下，在较低温度下即可达到色素最大溶出量，提取温度过高可能使色素结构发生改变。故本研究确定超声温度为60℃。

2.1.5 超声时间对色素提取效果的影响

在液料比、乙醇体积分数、超声温度、超声功率不变的条件下，当超声时间不超过60 min时，随着时间的延长，山核桃壳色素吸光度呈明显增大的趋势;但在超声时间为60～80 min范围内时，提取液的吸光度值变化不明显;当超声时间达到80 min后，如继续延长超声时间，提取液吸光度明显下降。这可能是由于超声时间过长，色素遭到破坏，同时考虑工作效率等因素，不宜长时间超声提取。故本研究确定超声提取时间为60 min。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 模型的建立与显著性检验

根据Box Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验影响结果，选择液料比(X1)、乙醇体积分数(X2)和超声功率(X3)3个因素，进行3因素3水平响应面分析试验。利用Design Expert 7.1.3软件对响应面试验数据进行二次多元回归拟合，得到山核桃壳色素吸光度与自变量X1、X2和X3的二次回归方程：Y=0.79+0.022X1+2.750×10-3X2+0.023X3-1.500×10-3X1X2+0.026X1X3-0.010X2X3-0.053-0.045-0.028X。

方差分析及显著性检验结果见表2。结果表明，该回归模型极显著(P=0.003 1＜0.01)，回归模型的决定系数为 R2=0.927 5，失拟项 P=0.064＞0.05，失拟性检验结果不显著。这说明该模型与数据拟合程度较高，实验误差小，可以用该模型分析和预测超声法辅助提取山核桃壳色素的结果。此外，回归方程各项的方差分析结果还表明，各因素中二次项对色素提取效果的影响极显著，一次项X1、X3和交互项X1X3对色素提取效果的影响显著。

表2 回归方程方差分析

2.2.2 响应面分析

当超声时间为60 min时，液料比和乙醇体积分数对山核桃壳色素提取效果的影响见图2。可以看出，当液料比不变时，随着乙醇体积分数的增加，山核桃壳色素吸光度先增大，当乙醇体积分数达到一定值后，呈逐渐下降的趋势。当乙醇体积分数在45%～55%范围内，液料比在10 mL∶1 g～20 mL∶1 g范围内，山核桃壳提取液的吸光度达到最大值。

图2 液料比和乙醇体积分数对吸光度影响的相应面图和等高线图

当乙醇体积分数为50%，液料比和超声功率对山核桃壳色素提取效果的影响见图3。可以看出，液料比和超声功率对色素吸光度的交互作用显著。当液料比不变，随着超声功率的提高，山核桃壳色素的吸光度逐渐增大;当超声功率达到一定值后，山核桃壳色素吸光度逐渐下降。当超声功率恒定，液料比在10 mL∶1 g～20 mL∶1 g范围内，山核桃壳色素吸光度先逐渐增大，达到极值后显著下降。

当超声功率为140 W，乙醇体积分数和超声功率对山核桃壳色素提取效果的影响见图4。可以看出，当超声功率不变，随着乙醇体积分数的提高，山核桃壳色素吸光度值先增大;当乙醇体积分数达到一定值后，山核桃壳色素吸光度值呈逐渐下降的趋势。当乙醇体积分数恒定在40%～50%范围内，超声功率在120～160 W范围内，山核桃壳色素提取液吸光度值随着超声功率的提高而增大，并达到最大值。同时说明，二者的交互作用中超声功率相对于乙醇体积分数而言居于主要方面。

由 Design-Expert7.1.3 Trial软件分析出超声波辅助提取山核桃壳色素的最佳条件：液料比16.74mL ∶1 g、乙醇体积分数 49.57%、超声功率 151.54 W，山核桃壳色素吸光度的预测值为0.801。为了进一步验证山核桃壳色素最优的超声波辅助提取工艺，考虑到实际操作的情况，将最佳工艺条件修正为液料比17 mL∶1 g、乙醇体积分数50%、超声功率152 W。采用上述条件进行了3次重复试验，得出色素的平均吸光度为0.799，与理论预测值误差仅为0.3%，验证结果与预测值偏差较小，说明采用响应面法得到的工艺参数是可行的。

图3 液料比和超声功率对吸光度影响的相应面图和等高线图

图4 乙醇体积分数和超声功率对吸光度影响的相应面图和等高线图

2.3 超声辅助法与常规水浴法提取山核桃壳色素的比较

对上述已确定的超声波辅助提取山核桃壳色素最佳提取条件与常规水浴提取山核桃壳色素最佳提取条件(液料比20 mL∶1 g、乙醇体积分数50%、提取温度70℃、提取时间120 min)进行比较，同时对各自提取效果进行对比。试验结果表明，常规水浴法提取山核桃壳色素得到的提取液的吸光度平均为0.575，超声波辅助提取得到的色素提取液平均吸光度为0.799。所以，超声辅助法更有利于细胞中的有效成分快速释放溶出，可以提高山核桃壳色素的提取效果，同时可大大缩短提取时间。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法优化超声辅助提取山核桃壳色素的提取工艺，建立了超声波辅助提取山核桃壳色素多元回归模型，模型拟合度良好。确定了山核桃壳色素的最佳提取条件：V(溶液)∶m(山核桃壳)=17 mL∶1 g、乙醇体积分数50%、超声功率152 W，山核桃壳色素吸光度的预测值为0.801，通过优化方案的验证实验得出色素的吸光度为0.799。

用常规水浴法提取山核桃壳色素吸光度为0.575，与其相比超声辅助提取法更为有效。其原因在于超声的热效应使局部升温，促进了色素的溶出;另外超声波空化时产生极大压力，有利于提高组织细胞壁的通透性，使色素更易被提取。至于更深入的超声波对山核桃壳色素结构和性质等的影响有待进一步研究。

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