中药复方对嗜水气单胞菌的抗菌试验

杨仕群，阳 刚

(四川省宜宾职业技术学院，四川宜宾 644003)

随着水产养殖业的快速发展，高密度养殖、水质的恶化使养殖的水产动物疾病频发，抗生素使用范围和用量不断增加，不仅污染了水环境，而且对人类的健康造成了威胁。

气单胞菌在细菌分类上属于弧菌科气单胞菌属，嗜水单胞菌是其中一种，广泛分布于池水、淤泥等自然环境[1-2]。嗜水气单胞菌可引起淡水鱼类及蛙、鳖等多种水产动物的败血症和人类腹泻，往往给淡水养殖业造成严重的经济损失。目前，其主要的治疗方法为应用各类抗生素，但随着长时间的应用抗生素，导致水产品药物残留及病原菌的耐药性逐渐加强的问题日益突出。而中草药是天然药物，因其具有无抗药性、无残留、无副作用、无环境污染、不引发药源性疾病，且抑菌杀菌效果明显，备受人们关注[3-5]。本研究在单味中草药抑菌的基础上，初步筛选了12种中草药组成5个复方，旨在为草鱼细菌性败血病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病原菌 病原菌是从患典型细菌性败血症的草鱼肝脏中分离的，经纯化并测定其毒力后由宜宾职业技术学院微生物实验室鉴定为嗜水气单胞菌。

1.1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，氯化钠 5.0g，琼脂 20g。

1.1.3 中药 实验选用文献已报道或临床应用的水产常用中草药，由不同单方药物配组构成多个复方，主要成分为五倍子、乌梅、黄连、黄芩、诃子等。试验用药购于宜宾市医药公司。

1.2 方法

1.2.1 药液制备 将中药先在干燥箱内(40℃)烘干，用粉碎机打成粉状，按设计复方(编号：A、B、C、D、E)称取粉状原料，混合均匀备用。称取复方中草药各20g，分别放至烧杯加蒸馏水煎煮三次，每次30min，用精密滤纸过滤去渣，将药液浓缩至1：20浓度，抽滤除菌后作为实验母液。再用无菌生理盐水将药液稀释至设计的浓度(参照各药的MBC)。

1.2.2 菌悬液的制备 少量的液体培养基接种嗜水气单胞菌后震荡培养12～16h。菌液培养好后用液体培养基稀释到合适浓度。本实验中菌液浓度为1×107个／mL。

1.2.3 复方中草药抑菌定性试验 固体培养基平板直径约90.0mm，培养基厚度约3.6mm，在平板上均匀涂布100ul嗜水气单胞菌悬液；待菌干后，分别贴上用直径为6.0mm无菌滤纸片沾各复方药母液后制成的纸片，并设无菌生理盐水为对照，放在恒温箱内(28℃)培养24 h后，观察并用游标卡尺测量抑菌圈。

1.2.4 复方中草药抑菌MIC及MBC的测定 参照陈学年[6]等的试验方法进行，即采用96孔板微量双倍稀释法(共8排，每排12个孔，孔底呈U形，每孔容量为0.25ml，各孔先加50ul普通肉汤培养液，然后用微量移液器吸取50ul中药母液至第1个孔，混合均匀后又从第1孔吸取50ul至第2孔，依次类推双倍稀释至第11孔，最后从第11孔吸取50ul弃去，第l2孔不加药液作为对照)，将各复方药稀释成不同浓度梯度，接种嗜水气单胞菌(50ul)后放在恒温箱内(28℃)培养24h，观察记录 (黑背景下观察刚澄清透明者)最低抑菌浓度(MIC)，在此基础上再培养24h观察记录，确定最低杀菌浓度(MBC)。

2 结果

2.1 复方中草药抑菌定性实验结果 用于试验的五个复方中，A对嗜水气单胞菌有很强的抗菌作用。C、D有中等程度的抗菌作用，其余复方抗菌作用较弱。结果见表1。

表1 五种复方中草药抑菌结果

2.2 复方中草药抑菌MIC及MBC测定结果 对A、B、C、D、E 五组中草药的对嗜水气单胞菌的MIC及MBC分别进行测定，结果见表2。

表2 五种复方中草药MIC及MBC测定结果

表2结果显示，A、B、C、D、E 5组复方中草药对嗜水气单胞菌的MIC分别为25mg/L、98mg/L、49mg/L、49mg/L、195mg/L；MBC分别为 49mg/L、195mg/L、98mg/L、98mg/L、391mg/L。

3 讨论

本试验5组复方中草药对嗜水气单胞菌进行体外抗菌试验研究，发现A、C、D三组复方中草药对嗜水气单胞菌的抑菌和杀菌效果最好，这与陈学年等[6]的研究结果相似。该三组复方中草药主要成分为五倍子、黄连、黄芩等，主要以清热解毒功效为主，性寒；而嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症多发生在高温季节，属于“热性病”，“热者寒之”和“热病寒药”的中医辨证治疗理论在此得到验证。

[1]张海宾，杨桂芳.12种中草药对嗜水气单胞菌杀伤能力的研究[J].水产科学，2006，25（1）：16-18..

[2]曹红峰，宋靖芳，李国庆等.中草药对嗜水气单胞菌ST-3-3抑菌作用的研究[J].中医药导报，2007，13（5）：86-88.

[3]王文博，汪建国，李爱华，等.中草药应用于水产养殖的研究概况[J].中国水产，2006，7：60-61.

[4]向枭，周兴华.中草药添加剂在水产养殖上的应用[J].粮食与饲料工业，2000，3：27-29.

[5]曹红峰，黄文芳，宋靖芳.中草药防治鱼病研究进展[J].海洋科学，2006,30(4):83-87.

[6]陈学年，郭玉娟.中草药防治鲫鱼败血症试验[J].淡水渔业，2001，31（1）：43-45.