105株携带耶尔森菌强毒力岛大肠杆菌的毒力基因型和部分菌株毒力因子序列研究

吕殿红，魏文康，黄 忠，温肖会

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州510640)

(Guangdong Key Laboratory of Veterinary Public Health,Institute of Veterinary Medicine,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China)

在大肠杆菌(Escherichia coli)侵袭宿主组织引起发病的过程中，毒素、黏附素、外膜蛋白等毒力因子相互协调、发挥作用。耶尔森菌强毒力岛(High pathogenicity island，HPI)是细菌重要的致病因素，也是E.coli重要的毒力因子[1]，其中irp2为铁调节蛋白，为HPI的标志基因；fyuA为鼠疫菌素受体基因，具有鼠疫菌素和耶尔森菌素双重受体功能，irp2、tsh、iucD、iss基因均与细菌的铁调节、摄取有直接或间接的关系，而且在致病性E.coli上出现的频率较高[2-3]。本研究采用PCR方法对105株HPI+E.coli进行了4种毒力基因(fyuA、tsh、iucD、iss)的检测，对部分菌株的相关基因进行了克隆与序列分析，研究HPI+E.coli菌株中fyuA基因的出现几率，以及与其他毒力因子出现的频率，为进一步了解E.coli毒力因子流行状况提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株与质粒 PCR检测HPI毒力岛标志基因irp2基因阳性的E.coli105株[4]，包括80个禽源分离株和35个猪源分离株，均来自发病养殖场；宿主菌DH5α购自广州合达生物技术有限公司；pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂及酶 dNTP、ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker等购买自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引 物 5种毒力基因(irp2、fyuA、tsh、iucD、iss)的引物分别参考文献[4]～[6]设计，参考基因的序列登录号分别为 L18881、Z38065、AF218037、M18968和X52665，由上海英潍捷基生物有限公司合成，扩增的irp2、fyuA、tsh、iucD和iss基因片段分别是1 037 bp、948 bp、825 bp、714 bp和309 bp。

1.4E.coliDNA模板的制备 取单个菌落接种LB液体培养基，采用热裂解法分别制备菌株的DNA模板。

1.5 毒力基因的PCR检测及序列研究 检测105株HPI+菌中的fyuA、tsh、iucD、iss4种基因，分别按文献[4]～[7]中程序进行。对检测出不同毒力因子的阳性菌株，按动物来源和分离年限随机挑选5株～7株分别进行irp2、fyuA、tsh、iucD和iss序列研究，PCR扩增毒力因子的片段，纯化后连接于pMD18-T载体中，菌液PCR鉴定阳性的进行测序，分析其序列。

2 结果与讨论

2.1 几种毒力因子携带情况 105株HPI+菌株的其他4种毒力因子携带情况不尽一致，有58株携带有fyuA(占 55.24%)，18株携带tsh基因(阳性率为17.14%)，基因iucD和iss的阳性率分别为49.52%(52/105)和23.81%(25/105)。105株受试菌有 13种基因型，各种基因型之间，携带irp2+fyuA+iucD+和仅含irp2+的菌株数之间无差异，其余基因型的菌株数均明显低于irp2+基因型(p<0.01)(表1)。

表1 105株HPI+E.coli的基因型分布Table 2 Genotype identifications of 105E.colistrains with HPI

尽管致病性E.coli通常集中于某些特定的血清型，但目前的研究表明E.coli的致病性并不完全与血清型有关，而主要与某些毒力因子密切相关，如毒素、菌毛以及毒力岛等，毒力因子的检测已经成为确定致病性E.coli的常用方法。耶尔森菌HPI最早发现于耶尔森菌属，研究表明在多种肠杆菌属的细菌中均有存在，而且可以在耶尔森氏菌和E.coli之间水平传播，与致病性E.coli的毒力进化密切相关，一些E.coli携带的irp2、fyuA序列与耶尔森氏菌的几乎相同[8]。irp2、fyuA、tsh、iucD和iss基因与E.coli的致病性关系均很密切，这些菌株中，不同基因型的致病性表现也不尽相同[9]。本研究中HPI+菌中基因fyuA的携带率为55.24%(58/105)，远低于成大荣等报道的 72.5%(29/40)的阳性率(p<0.01)，于学辉等在26株鸭源HPI+E.coli中检出25株含fyuA基因[7,10]，检出比率远远高于本研究中的结果；产生差异的原因有待于深入研究。

2.2 5种毒力因子基因序列同源性研究 研究结果显示，各基因片段长度均与预期相同。6个irp2基因序列的同源性在99.2%～100%，与参考序列的同源性在98.0%以上；5个fyuA基因序列的同源性为99.4%～99.9%，与参考序列的同源性在98.8%～99.2%之间；6个tsh基因序列的同源性在99.8%～100%，与参考序列的同源性在99.5%～99.6%；5个iucD基因序列的同源性在99.4%～99.9%，与参考序列的同源性为96.6%～97.0%；7个iss基因序列的同源性在88.0%～100%，与参考序列的同源性为88.0%～90.9%。

对5种毒力因子序列的研究表明，irp2、fyuA、tsh和iucD基因与GenBank中的参考序列同源性很高；而iss基因序列却有所差异。本研究中，受试的7株菌中，除P100、P112为禽源株，其他均为猪源，并且来源地和分离时间均有不同，但除P100与参考序列呈现高同源性外，其他6株之间的同源性很高，而与P100株和参考序列相比，却有较大差异；所以推测iss基因在细菌进化过程中发生了较大程度的变异，而且在不同动物源的E.coli中发生了水平传递；导致这种变异的原因尚待进一步研究。

[1]Clermont O,Bonacorsi S,Bingen E.TheYersiniahigh-pathogenicity island is highly predominant in virulence-associated phylogenetic groups ofEscherichia coli[J].FEMS Microbiol Lett,2001,196(2):153-157.

[2]余淑冰，梁景涛，周强忠，等.佛山市食品中致泻大肠埃希菌菌型分布及毒力研究[J].中国热带医学，2004，4(3)：322-324.

[3]Ewers C,Janssen T,Kiessling S,et al.Molecular epidemiology of avian pathogenicEscherichia coli(APEC)isolated from colisepticemia in poultry[J].Vet microbiol,2004,104(1-2):91-101.

[4]吕殿红，胡奇林，周秀蓉，等.广东省发病猪禽大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分布[J].中国兽医科学，2010，40(7)：680-682.

[5]Schubert S,Rakin A,Karch H,et al.Prevalence of the"highpathogenicity island"ofYersiniaspecies amongEscherichia colistrains that are pathogenic to human[J].Infect Immun,1998,66(2):480-485.

[6]金文杰.禽致病性大肠杆菌耐药基因和毒力因子的分子流行病学研究及HPI Irp1细胞表位作用的研究[D].扬州：扬州大学，2006.

[7]成大荣，孙怀昌，徐建生，等.断奶仔猪源大肠杆菌LEE及 HPI毒力岛的检测[J].微生物学报，2006，46(3)：368-372.

[8]Rakin A,Schubert S,Guilvout I,et al.Local hopping of IS3 elements into the A+T-rich part of the high-pathogenicity island inYersiniaenterocolitica1B,O:8[J].FEMS Microbiol Lett,2000,182(2):225-229.

[9]吕殿红，周秀蓉.携带耶尔森强毒力岛的大肠埃希菌耐药性及其对雏鸭的致病性试验[J].动物医学进展，2011，32(1)：50-54.

[10]于学辉，王英，王远微，等.鸭致病性大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛的分子流行病学调查[J].西南民族大学学报·自然科学版，2007，33(6)：1316-1320.