白藜芦醇对糖尿病肾损害大鼠超微结构的影响

傅松波 汤旭磊 杨晓梅 马致远 (兰州大学第一医院内分泌科，甘肃 兰州 730000)

氧化应激与糖尿病慢性微血管并发症密切相关〔1，2〕，抗氧化剂预防糖尿病血管并发症的价值为人们所关注。近年来，对中医中药的研究发现，丹参、当归、银杏等制剂能抑制体内氧化应激反应，对糖尿病肾病(DN)大鼠有保护作用，临床应用也有一定的效果，但仍不能抑制糖尿病患者肾损害的发生发展。白藜芦醇(Res)是一类主要存在于葡萄、藜芦等植物中的多酚类化合物，是红葡萄酒中发挥心血管保护作用的主要功能因子〔2〕。研究发现，口服Res对环孢霉素A引起的肾毒性大鼠有保护作用〔3〕;Sharma等〔4〕给大鼠喂养 Res，能预防丙三醇所致的急性肾衰竭，并进一步发现与其抗氧化作用有关;Palsamy等〔5〕发现，通过对DN大鼠口服6 Res w，可以使尿蛋白量、血尿素氮和肌酐下降，但缺乏观察光镜下肾脏形态学变化以及电镜超微结构的改变。本研究旨在探讨腹腔注射Res对早期实验性糖尿病大鼠肾脏损害的影响，从氧化应激的角度探讨Res减轻糖尿病大鼠肾脏损害的机制，为临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 白藜芦醇购自天津尖峰天然产物有限公司，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，总抗氧化力(TAC)、巯基(SH)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物公司。血糖检测采用美国强生血糖仪。雄性 Wistar大鼠，体重(256.2±9.4)g，由兰州军区总医院动物实验中心提供。

1.2 糖尿病动物模型制备、分组与处理 将Wistar大鼠随机分三组，正常对照组(NC)9只、糖尿病组(DC)11只和白藜芦醇治疗组(Res 10 mg·kg－1·d－1)11只，三组大鼠喂以高糖高脂饲料(饲料组成:10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料)，体重达到400 g左右时，DC和Res组给予STZ(溶于新鲜配制的0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，pH4.5)，以30 mg/kg体重腹腔注射。72 h后尾静脉采血测定空腹血糖，以血糖≥16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型，大鼠成模后1 w开始腹腔注射给药，NC和DC组给等量溶媒，用药10 w后处死。所有大鼠自由饮水，给予高糖高脂饲料，每周称体重和剪尾法测血糖，不使用胰岛素及其他降糖药。

1.3 观测指标及检测方法 用药10 w时用代谢笼收集24 h尿液，测尿蛋白排泄量。剪断右股骨动脉取血，测尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，用比色法检测丙二醛(MDA)、巯基(SH)、总抗氧化力(TAC)。大鼠处死后迅速取出左肾，去包膜称重，计算肾脏指数(肾重量g/体重g×1 000);取小块肾皮质用3%戊二醛固定，待电镜观察，并测定肾小球基底膜(GBMT)厚度，剩余部分制成10%的组织匀浆，待测MDA、SH和TAC。右肾置于4%多聚甲醛液中常规固定、石蜡包埋，用于常规HE染色观察肾小球形态学改变，计算肾小球体积(MGV)。

2 结果

2.1 大鼠一般情况及血糖、体重变化 大鼠成模后出现多食、多饮、多尿、体重下降，皮毛枯黄，行动迟缓，反应迟钝等表现，并逐渐加重。Res对糖尿病大鼠血糖无显著影响。实验中，DC组死亡2只，Res组1只。

2.2 各组大鼠血浆和肾皮质匀浆TAC、SH和MDA含量的变化 与NC组大鼠比较，DC组血浆和肾皮质中的MDA含量明显升高，TAC、SH明显降低(均P＜0.01)，Res能明显降低糖尿病大鼠血浆和肾皮质MDA含量，升高TAC、SH水平(P＜0.01，P＜0.05)。见表1。

2.3 白藜芦醇对糖尿病大鼠肾脏病理超微结构和功能的影响HE光镜切片:DC组大鼠肾小球肥大，毛细血管内皮细胞肿胀，系膜区扩大(图1)。电镜下可见肾小球基底膜明显增厚，足突触合消失，系膜区增宽，系膜细胞增多，系膜外基质增多，肾小管上皮细胞肿胀(图2)。与NC组比较，DC组血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿蛋白明显升高;肾小球体积、肾脏指数和GMBT明显增大、增厚(P＜0.01，P＜0.05)。见表2。Res治疗组上述各指标均明显改善，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)。见表2。

表1 大鼠血清和肾皮质MDA、TAC、SH的含量(±s)

表1 大鼠血清和肾皮质MDA、TAC、SH的含量(±s)

与 NC组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与 DC组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01，下表同

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表2 Res对糖尿病大鼠GMBT、MGV、肾脏指数、血清BUN、Cr、尿蛋白的影响(±s)

表2 Res对糖尿病大鼠GMBT、MGV、肾脏指数、血清BUN、Cr、尿蛋白的影响(±s)

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图1 各组大鼠肾小球体积形态学改变(HE，×400)

图2 各组大鼠肾小球基底膜形态学电镜观察(×10 000)

3 讨论

本实验用高脂高糖饲料培育肥胖大鼠，再以小剂量STZ腹腔注射诱导糖尿病，更符合成人2型糖尿病生理特点，糖尿病大鼠成模后11 w其血BUN、Cr及尿蛋白排泄水平升高，同时伴有肾小球肥大、系膜区增宽等一系列超微病理结构改变，说明已有糖尿病性肾脏损害，与文献报道大鼠DN模型表现相一致〔6〕。高血糖诱发的反应性氧自由基参与糖尿病微血管并发症的发生，在未出现肾脏组织学改变以前的糖尿病早期，体内脂质过氧化产物水平已明显增高，抗氧化酶活性已明显降低〔7〕。本研究结果表明，与正常大鼠比较，糖尿病大鼠血清和肾皮质中的脂质过氧化产物MDA含量明显升高，TAC、SH明显降低，说明糖尿病大鼠体内持续存在着全身和肾脏局部的氧化与抗氧化失衡。氧化应激可能直接或间接参与了糖尿病大鼠的肾脏损伤，在DN发病机制中起重要作用，那么抗氧化治疗就应该能减轻或防止糖尿病肾损伤。

Res为良好的抗氧化剂，Hung等〔8〕研究证实Res对心肌缺血保护作用是通过其抗氧化作用实现的，其抗氧化作用强于维生素E和维生素C;King等〔9〕研究证实在人视网膜色素上皮细胞培养中，加入H2O2诱导形成的氧化应激状态，Res能清除ROS并抑制其增殖;Kumar等〔10〕研究发现Res能明显改善DM神经病变大鼠运动神经的传导速度;Ates等〔11〕进一步研究发现Res对糖尿病神经病变保护作用与其抗氧化作用有关。本研究结果显示，对实验性糖尿病大鼠早期应用Res，在不干预高血糖的情况下，改善糖尿病大鼠全身和肾脏局部的氧化应激状态可以显著抑制糖尿病大鼠肾小球体积增大和毛细血管基底膜增厚，通过对超微病理学结构的改变，从而减少尿微量白蛋白的排泄、降低血BUN和Cr，改善肾功能。证明了Res对糖尿病大鼠早期肾损害的超微结构具有保护作用。Res能显著改善糖尿病大鼠体内的氧化应激状态，改善肾小球肥大，抑制肾小球基底膜增厚，减轻蛋白尿，从而起到防治糖尿病肾病的作用。

1 Stadler K，Jenei V，von BG，et al.Role of free radicals and reactive nitrogen species in the late complications of diabetes mellitus in rats〔J〕.Orv Hetil，2004;145(21):1135-40.

2 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature，2001;414(6865):813-20.

3 Chander V，Tirkey N，Chopra K.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin protects against cyclosporine-induced nephrotoxicity through nitric oxide dependent mechanism〔J〕.Toxicology，2005;210(1):55-64.

4 Sharma S，Anjaneyulu M，Kulkarni SK，et al.Resveratrol，a polyphenolic phytoalexin，attenuates diabetic nephropathy in rats〔J〕.Pharmacology，2006;76(2):69-75.

5 Palsamy P，Subramanian S.Resveratrol protects diabetic kidney by attenuating hyperglycemia-mediated oxidative stress and renal inflammatory cytokines via Nrf2-Keap1 signaling〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011;1812(7):719-31.

6 傅松波，汤旭磊，贾丽云，等.苦参碱对糖尿病大鼠肾脏的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(3):376-8.

7 Brouwers O，Niessen PM，Ferreira I，et al.Overexpression of glyoxalase-I reduces hyperglycemia-induced levels of advanced glycation end products and oxidative stress in diabetic rats〔J〕.J Biol Chem，2011;286(2):1374-80.

8 Hung LM，Chen JK，Huang SS，et al.Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes〔J〕.Cardiovasc Res，2000;47(3):549-55.

9 King RE，Kent KD，Bomser JA.Resveratrol reduces oxidation and proliferation of human retinal pigment epithelial cells via extracellular signal-regulated kinase inhibition〔J〕.Chem Biol Interact，2005;151(2):143-9.

10 Kumar A，Kaundal RK，Iyer S，et al.Effects of resveratrol on nerve functions，oxidative stress and DNA fragmentation in experimental diabetic neuropathy〔J〕.Life Sci，2007;80(13):1236-44.

11 Ates O，Cayli SR，Yucel N，et al.Central nervous system protection by resveratrol in streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.J Clin Neurosci，2007;14(3):256-60.