卡托普利和氯沙坦对血管性痴呆模型大鼠海马神经元凋亡和蛋白表达的影响

黄新武 李 华 李国春 熊玉霞 张 红 秦大莲 (泸州医学院药学院药理教研室，四川 泸州 646000)

血管性痴呆(VD)不仅严重损害患者的健康，影响患者的生命质量，也给家庭和社会带来沉重负担，因此，积极探寻防治VD的有效途径具有重要医学价值和社会意义。有研究表明〔1〕，脑内具有独立的肾素-血管紧张素系统(RAS)，其在VD发病中起重要作用。卡托普利是最常用的一种血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)，可直接抑制ACE的活性，减少AngⅡ的生成;氯沙坦属血管紧张素1型受体(AT1受体)阻滞药，通过阻滞AT1受体对抗AngⅡ的作用。本研究复制大鼠VD模型，通过Morris水迷宫法观察卡托普利和氯沙坦对VD模型大鼠学习记忆能力有良好改善的作用〔2〕，本文对模型大鼠海马细胞凋亡及Bcl-2及Bax蛋白表达的影响进行研究，探讨其改善VD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，月龄＞24个月，体重(320±20)g。泸州医学院实验动物科提供，为一级合格动物。

1.2 材料 卡托普利由汕头金石制药总厂生产，批号080505;氯沙坦钾胶囊，由北京万生药业有限责任公司生产，批号:20080903。凋亡TUNEL试剂盒购自美国ROSS公司，兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体、SABC、DAB染色试剂盒、苏木素均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 VD大鼠模型制备及分组 随机取40只大鼠，采用不同时点分别结扎左、右颈总动脉制备VD模型〔3〕。术后4 w通过Morris水迷宫对制模大鼠进行学习记忆能力的测定，筛选出学习记忆能力明显障碍，制模不合格10只剔除，模型制备成功30只大鼠，并随机分为3组，每组10只。根据药品说明书常用量体重计算给药剂量，卡托普利组，卡托普利予2.5 mg/kg，灌胃，1次/d，持续4 w;氯沙坦组:氯沙坦予2.0 mg/kg，灌胃，1次/d，持续4 w;模型组:等量生理盐水灌胃;假手术组10只，双侧颈总动脉不结扎，余同模型大鼠，予等量生理盐水灌胃。

1.4 组织标本处理 学习记忆能力的测定后将动物给予4%多聚甲醛灌注30 min。断头取脑放入4% 多聚甲醛固定，依次酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。连续冠状切片，片厚5 μm。

1.5 免疫组织化学法检测Bcl-2、Bax的表达 参照Bcl-2、Bax试剂盒说明，按常规SABC法进行，DAB显色，苏木素复染。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡 参照TUNEL试剂盒说明进行。

1.7 结果观察 在显微镜下观察每张切片TUNEL阳性细胞、Bcl-2、Bax免疫阳性细胞的表达情况，分析指标运用GD-10.0多媒体彩色病理图文分析系统进行测定，以灰度计算所选视野阳性染色的单位面积(阳性细胞的面积占所选整个视野面积的百分比)，每张切片取梗死灶边缘区互不重叠的5个视野，其均值即为该标本每个高倍镜视野中阳性细胞的单位面积。

1.8 病理检查 大脑中部冠状切取3 mm大脑厚片，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切4 μm切片，HE染色。

2 结果

2.1 海马神经元凋亡情况 显微镜下观察，TUNEL染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，神经元体积缩小，呈三角形或扇形，尼氏小体消失，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质浓集于核周，呈新月形、环形、长条形、块状小体甚至形成核碎片。而阴性神经元的胞核则不显示黄色，神经元形态正常。假手术组大鼠海马组织中只有零星的凋亡神经元;而模型组大鼠可见大量凋亡神经元，呈成簇出现，与假手术组比较有显著意义(P＜0.05)。卡托普利组和氯沙坦组大鼠凋亡神经元均明显减少，与模型组比较有显著意义(P＜0.05)。见表1，图1。

2.2 海马Bcl-2和Bax蛋白的表达情况 显微镜下观察，各组大鼠海马Bcl-2、Bax阳性神经元染色均以胞浆有棕黄色物质沉积为主，也有部分胞膜及核膜着色，并可显示神经元轮廓。Bcl-2阳性神经元变性较轻，形态接近正常，胞体不肿胀，基本上呈椭圆形，边缘较光滑。而Bax阳性神经元变性较重，胞体形状不规则，边缘欠光滑。假手术组大鼠海马Bcl-2、Bax均呈少量表达。模型组大鼠Bcl-2及Bax蛋白表达均明显增加，与假手术组比较有显著意义(P＜0.05)。卡托普利组和氯沙坦组大鼠Bcl-2及Bax蛋白表达有明显改善。见表1，图2，图3。

2.3 病理形态学 图4可见HE染色后神经细胞质淡红色，核呈蓝褐色。假手术组大鼠海马神经元排列整齐、密集，细胞完整、结构正常，胞质丰富;细胞核呈圆形、椭圆形，无变性，无固缩及溶解现象。模型组大鼠海马神经元数量明显减少，排列紊乱，变性明显，体积缩小，胞核与胞质界限不清，核固缩成三角形或不规则形。卡托普利组和氯沙坦组大鼠海马缺血坏死较模型组大鼠明显减轻。

表1 海马神经元凋亡及蛋白表达情况(%，±s，n=10)

表1 海马神经元凋亡及蛋白表达情况(%，±s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 细胞凋亡 Bcl-2蛋白表达 Bax 蛋白表达假手术组 4.38±1.342) 5.21±1.142) 3.61±1.552)卡托普利组 11.34±2.142) 23.41±2.171) 9.47±3.112)氯沙坦组 15.22±2.412) 21.53±2.731) 11.26±2.562)模型组 39.24±5.471) 20.08±3.171) 28.93±3.681)

图1 各组海马神经元凋亡情况(×200)

图2 海马Bcl-2蛋白表达(DAB，×200)

图3 海马Bax蛋白表达情况(DAB，×200)

图4 各组大鼠海马病理形态学变化(HE，×100)

3 讨论

细胞凋亡与许多疾病的发生有密切关系。细胞凋亡机制在VD研究中受到越来越重视。脑神经元对凋亡损伤极其敏感，在脑缺血的病理过程中存在细胞凋亡这一病理机制。现代医学研究表明，细胞凋亡的直接原因可能是凋亡细胞内基因表达的结果。其中 Bcl-2蛋白家族成员起着至关重要作用〔4〕。Bcl-2和Bax是其家族中调控细胞凋亡的两个主要基因，Bcl-2从人淋巴细胞分离出来的具有阻抑细胞凋亡的1个原癌基因，它在中枢神经系统中作为1种有效的抑制神经元凋亡和坏死的因子，可促进神经元的存活以及突触的再生〔5〕。Bax蛋白是细胞凋亡的激动剂〔6〕。Bax蛋白可自身形成同源二聚体，并易与Bcl-2蛋白形成异源二聚体复合物，Bcl-2表达相对增多时Bcl-2/bax二聚体增多，消除Bax的促凋亡效应，而Bax表达相对增多时Bax/Bax二聚体增加，促凋亡作用上升。因此，一旦Bax蛋白大量表达时，细胞便走向死亡。研究结果显示，VD模型组大鼠海马可见大量成簇凋亡神经元。模型组大鼠Bcl-2及Bax蛋白表达均增加，但Bax蛋白表达似乎更明显。卡托普利组和氯沙坦组大鼠凋亡神经元均明显减少，Bcl-2及Bax蛋白表达也有明显改善。

病理检查结果也显示，VD模型组大鼠的海马神经元数量明显减少，缺血坏死明显。卡托普利组和氯沙坦组大鼠海马缺血坏死明显减轻。海马是与认知功能相关的重要脑区，是学习、记忆的高级中枢，它直接参与信息的贮存和处理。由于海马神经元的存活数量直接影响神经元突触的可塑性效应，从而影响海马对信息的处理和传递。因此，卡托普利和氯沙坦能减轻海马神经元大量凋亡丢失，可能是改善患者脑缺血后引起VD学习记忆障碍的重要机制之一。

1 Ciobica A，Bild W，Hritcu L，et al.Brain renin-angiotensin system in cognitive function:pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia〔J〕.Acta Neurol Belg，2009;109(3):171-6.

2 黄新武，李 华，秦大莲，等.卡托普利和氯沙坦对血管性痴呆模型大鼠学习记忆的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2010;12(6):497-8.

3 黄新武，李 华，秦大莲，等.不同时点分别结扎左、右颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(14):2006-07.

4 Tsukahara S，Yamamoto S，Tin-Tin-Win-Shwe，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the bcl-2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice〔J〕.Neuroimmunomodulation，2006;13(2):63-8.

5 Wada A，Yokoo H，Yanagita T，et al.Lithium:potential therapeutics against acute brain injuries and chronic neurodegenerative diseases〔J〕.J Pharmacol Sci，2005;99(4):307-21.

6 Adams JM，Huang DC，Strasser A，et al.Subversion of the bcl-2 life/death switch in cancer development and therapy〔J〕.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，2005;70:469-77.