ZNF580在1－磷酸鞘氨醇诱导内皮细胞迁移和增殖中的作用*

韦淑萍， 孙慧燕， 刘 未， 张文成△

(武警后勤学院 1人体解剖学教研室，2生理学与病理生理学教研室，天津 300162)

ZNF580是一个cDNA全长为1726 bp的新基因(GenBank注册号:AF184939)，编码172个氨基酸组成的蛋白质，其C端94～172位氨基酸序列中含有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白结构域[1]。本组前期研究证实ZNF580在人多种组织中均有表达且融合有绿色荧光蛋白的ZNF580主要聚集于HEK293 和 MGC803 细胞的细胞核中[2－3]。C2H2型锌指蛋白是人体最重要的一类调控蛋白，锌指转录因子不仅与基因表达、细胞分化、配子形成、胚胎发育等生命现象密切相关，而且它的分子结构变异与多种疾病及肿瘤相关[4]。GEO数据库显示:锌指蛋白ZNF580在损伤的动脉组织及慢性肝炎、缺氧等疾病中表达均上调，提示ZNF580可能参与血管发生的转录调节过程。

血管发生是新生血管的形成方式，在肿瘤生长、组织修复、免疫反应、风湿性关节炎、缺血性疾病、糖尿病性视网膜病等病理情况下起到重要作用[5]，而内皮细胞的趋化、增殖、迁移、黏附和分化是生成新生血管的关键。多种细胞因子通过复杂的信号途径调控内皮细胞的增殖和迁移，从而诱导血管的发生。血管内皮细胞不仅是覆盖血管腔内表面的第一道屏障，而且是研究血管发生的良好模型。

1－磷酸鞘氨醇(sphingosine 1－phosphate，S1P)是溶血磷脂家族的重要成员，越来越多的证据证实S1P参与了内皮细胞迁移、分化、增殖、管道分化等血管发生的诸多过程[6－7]。S1P诱导的血管发生是通过与其特异性G蛋白耦联受体结合而发挥生物学效应。S1P作用于不同的受体，进一步通过 Gi、Gq、G12/13和 Rho 等途径来激活效应系统[8－9]，包括腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶 D(phospholipase D，PLD)、细胞外信号调节酶(extracellular signal－regulated kinase，ERKs)、c－Jun N 端激酶、p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38 mitogen－actived protein kinase，p38 MAPK)和非受体酪氨酸激酶，将信息传递到细胞核，以调节靶基因的开关或表达水平，进而发挥多种生物学效应。

然而，包含在S1P信号通路的核转录因子尚未报道，而且，ZNF580的转录调节作用还尚未被证实。基于以上两点原因，本实验意在研究新锌指蛋白ZNF580在S1P诱导的内皮细胞增殖和迁移中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 细胞株 人脐静脉内皮细胞株EA.hy926、真核表达载体pEGFP－ZNF580和pEGFP－C1均为本室常规保存。

1.2 试剂 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自 TBD;高糖 DMEM细胞培养液、MTT和DMSO购自Sigma;脂质体LipofectamineTM2000转染试剂与Trizol购自Invitrogen;RT－PCR试剂盒购自TaKaRa;PVDF膜购自Millipore;ZNF580多克隆抗体购自北京AVIVA生物工程有限公司;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯;各引物序列均由北京赛百盛公司合成，见表1。

表1 引物序列Table1.Sequences of the primers

2 方法

2.1 细胞培养 人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞用含10%BSA的高糖DMEM细胞培养液培养，37℃、5%CO2孵箱培养，3 d换液1次。取对数生长期细胞提取总RNA和蛋白。

2.2 细胞转染 取对数生长期EA.hy926细胞，将其悬浮于不含抗生素的DMEM培养基中，浓度约为5×109cells/L，接种到6孔板中2 mL/well，生长至90%～95%融合时分为 3组:正常组、pEGFPZNF580转染组和pEGFP－C1空载体对照组。每组设6个平行孔。按LipofectamineTM2000产品说明书的操作方法进行转染。于37℃、5%CO2条件下继续培养细胞48 h，收获细胞提取RNA和蛋白。

2.3 RNA干扰 上海吉玛公司化学合成3对RNA干扰序列(序列1～3)、1对阴性对照序列 (NC)和1对阳性对照序列(PC)，分别为:序列1上游引物5'－CUUCCAAAGGGAGGAGCAUTT －3'，下游引物 5'－AUGCUCCUCCCUUUGGAAGTT－3';序列2上游引物5'－CUUUCUAGCUGUGUGAUGUTT －3'，下游引物5'－ACAUCACACAGCUAGAAAGTT－3';序列3上游引物5'－GCACGUGCGCCUCCACUAATT－3'，下游引物5'－UUAGUGGAGGCGCACGUGCTG－3';NC上游引物5'－UUCUCCGAACGUGUCACGUTT－3'，下游引物 5'－ ACGUGACACGUUCGGAGAATT －3';PC上游引物5'－GUAUGACAACAGCCUCAAGTT－3'，下游引物 5'－CUUGAGGCUGUUGCAUACTT －3'。筛选出最佳干扰序列用于后续实验。

2.4 RT－PCR 按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度并定量(A260/A280值介于 1.80 ～2.00 之间)。用 1 μg 总RNA进行cDNA的合成，半定量RT－PCR检测目的基因转录表达水平。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳并分析各目的基因与β－actin基因条带吸光度值。

2.5 Western blotting 收集对数生长期细胞提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取各组样品与5×SDS凝胶加样缓冲液混合，煮沸变性5 min备用。取60 μg蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶，5%积层胶，稳压160 V)。湿转法转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后将膜置于装有Ⅰ抗的杂交袋中，室温孵育1～2 h后，4℃过夜。然后将膜置于装有Ⅱ抗稀释液的杂交袋中，室温下孵育1～2 h后，采用HRP－DAB显色，将胶片进行扫描，凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净吸光度值。同样步骤加入内参β－actin抗体，检测样品中β－actin的蛋白表达作为内参照。

2.6 Transwell细胞迁移实验 37℃孵箱孵育预先加入matrigel基质胶的Transwell小室(聚碳酸酯膜孔径8 μm)中过夜。无血清DMEM培养液饥饿细胞，次日消化并计数。向铺胶的Transwell小室上室中加入200 μL/well密度为1×109cells/L的细胞，下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培养基。37℃、5%CO2培养细胞48 h，用棉签擦掉上室残余基质胶和未穿过的细胞，下室固定染色，光镜下观察结果，计数细胞。每组设3个平行孔。

2.7 MTT比色法 0.25%胰酶消化对数生长期细胞成单细胞悬液，将浓度为1×107cells/L的细胞接种于96孔培养板中200 μL/well，每组细胞设6个平行孔。无血清细胞培养液同步化细胞。37℃、5%CO2，含10%BSA的DMEM培养液继续培养细胞48 h。每孔加入5 g/L MTT液20 μL，继续培养4 h，弃培养液，加入150 μL DMSO，酶标仪测定各孔490 nm处的吸光度(A)值。细胞增殖率(%)=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。实验重复3次。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 S1P增强EA.hy926内皮细胞ZNF580的表达

利用 S1P1、S1P2、S1P3、S1P4 和 S1P5 各受体的上、下游引物，以提取EA.hy926内皮细胞的总RNA作模板，经RT－PCR扩增cDNA的特异性片段，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测EA.hy926细胞S1P受体的表达情况。结果显示，EA.hy926内皮细胞表达S1P1、S1P3和S1P5受体，其cDNA的特异性扩增产物分别为352 bp、701 bp和236 bp，因此可作为研究S1P对EA.hy926细胞作用的良好模型，见图1。

Figure1.S1P receptor expression profile in EA.hy926 cells.M:DL2000 marker;β－actin:547 bp;S1P1:352 bp;S1P3:701 bp;S1P5:236 bp.图1 EA.hy926细胞表达S1P受体情况

1.1 剂量效应 EA.hy926内皮细胞用不同浓度的S1P(0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)刺激 4 h 后收集细胞(于加S1P前用无血清的DMEM培养液饥饿细胞12～16 h)，提取细胞总RNA和蛋白。结果显示，S1P处理的EA.hy926细胞 ZNF580 mRNA(图2A)和蛋白(图2B)表达水平呈浓度依赖性增高。S1P浓度为0.5 μmol/L时，ZNF580的表达达到峰值。

1.2 时间效应 EA.hy926内皮细胞用最适浓度S1P(0.5 μmol/L)孵育不同时间(0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h)后收集细胞(于加S1P前用无血清的HDMEM培养液饥饿细胞12～16 h)，提取细胞总RNA和蛋白。结果显示，S1P处理的 EA.hy926细胞ZNF580 mRNA(图3A)和蛋白(图3B)表达水平呈时间依赖性增高。S1P处理4 h，ZNF580的表达达到峰值。

Figure2.S1P upregulated both ZNF580 mRNA(A)and protein(B)levels in a concentration－dependent manner..n=6.*P＜0.05 vs control group.图2 S1P上调ZNF580 mRNA和蛋白的表达具有浓度依赖性

Figure3.S1P up－regulated both ZNF580 mRNA(A)and protein(B)levels in a time－dependent manner..n=6.*P＜0.05 vs control group.图3 S1P上调ZNF580 mRNA和蛋白的表达具有时间依赖性

2 S1P通过p38 MAPK信号通路影响ZNF580的表达

实验分为正常对照组、S1P处理组、SB203580+S1P处理组和DMSO+S1P阴性对照组。当细胞融合度为70%～80%时，在各组内分别加10 μmol/L培养基、10 μmol/L 培养基、10 μmol/L SB203580 和 10 μmol/L DMSO;1 h 后，对应组内分别加 0.5 μmol/L培养基、0.5 μmol/L S1P(最适浓度)、0.5 μmol/L S1P 和0.5 μmol/L S1P;4 h(最适时间)后收集细胞(处理前用无血清的DMEM培养液饥饿细胞12～16 h)。收集的细胞提取细胞总RNA和蛋白进行检测。结果显示，SB203580显著抑制了S1P对ZNF580表达的上调作用，见图4。

3 ZNF580促进内皮细胞迁移和增殖

利用脂质体转染法获得瞬时高表达和瞬时低表达ZNF580的内皮细胞，实验分为3组:EA.hy926正常组、pEGFP－ZNF580组和 ZNF580－siRNA组。Transwell迁移实验结果(图 5A)显示:pEGFPZNF580组迁移活性约为正常组的2.5倍，ZNF580－siRNA组迁移活性约为正常组的1/2(P＜0.01)。MTT增殖实验结果显示(图5B):pEGFP－ZNF580组增殖活性约为正常组的3倍，ZNF580－siRNA组增殖活性约为正常组的1/3(P＜0.01)。

Figure4.SB203580 partly inhibited S1P－induced up－regulation of ZNF580 mRNA(A)and protein(B)..n=6.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs S1P group.图4 SB203580抑制了S1P诱导的ZNF580表达的上调作用

Figure5.The effects of ZNF580 on endothelial cell migration(A，n=3)and proliferation(B，n=6)..＊＊P＜0.01 vs control group.图5 ZNF580对内皮细胞迁移和增殖的影响

讨 论

ZNF580是由本课题组克隆得到的一种新的锌指蛋白基因。氨基酸序列分析显示:ZNF580 N端5～88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，C端94～172位氨基酸序列中含有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白结构域。多数C2H2型锌指蛋白具有核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，在真核细胞内可穿过核孔进入细胞核内，作为核转录因子调控其它基因的表达。本组前期研究工作:将ZNF580编码区克隆到真核表达载体pEGFP－C1上，转染人胚肾上皮细胞系HEK293和胃癌细胞系MGC803进行瞬时表达，融合有绿色荧光蛋白的ZNF580蛋白主要聚集于上述细胞的细胞核中。ZNF580蛋白的核定位信号位于C端C2H2型锌指主构域94～172位氨基酸区间。然而，ZNF580在内皮细胞中迁移和增殖过程中的核转录作用至今尚不清楚。

S1P是溶血磷脂家族的一个重要成员，在细胞增殖、迁移、分化与凋亡及肿瘤形成等过程中发挥着非常重要的作用。S1P可与其特异性受体结合，通过多种信号通路(腺苷酸环化酶、磷脂酶C、c－Jun、p38 MAPK等)将信息传递到细胞核，激活核转录因子，从而发挥作用。我们的实验欲在S1P这个平台上研究人C2H2型锌指蛋白ZNF580这个核转录因子在内皮细胞增殖和迁移中的作用。

本实验首先检测了EA.hy926内皮细胞S1P受体表达情况。结果显示，EA.hy926细胞表达S1P1、S1P3和 S1P5三种S1P受体。故EA.hy926可作为研究ZNF580在S1P诱导内皮细胞迁移和增殖作用的良好模型。

接下来检测了 S1P刺激 EA.hy926细胞后ZNF580的表达情况。结果显示，S1P刺激EA.hy926细胞后，ZNF580 mRNA和蛋白的表达均增加，且有剂量(0～10 μmol/L)和时间(0～12 h)效应。故推测ZNF580可能参与了S1P诱导EA.hy926细胞后的生物学过程。有研究证实，S1P与其受体结合，通过激活重要的激酶，如p38 MAPK等信号通路影响内皮细胞的迁移和增殖。我们检测了p38 MAPK特异性信号通路抑制剂SB203580对ZNF580表达的影响，发现 p38 MAPK特异性信号通路抑制剂SB203580能够抑制S1P诱导的ZNF580的上调作用，说明S1P诱导的ZNF580表达通过p38 MAPK信号通路。MAPKs在细胞核发挥作用，其作用底物为核转录因子。而且，经分子生物学网站分析:ZNF580蛋白14～17位 SSPE、93～96位SCPE和113～116位SHSD氨基酸为酪蛋白激酶II磷酸化作用位点(casein kinase II phosphorylation site);60～65位GVPYTY氨基酸为N－豆蔻酸化位点(N－myristoylation site);109～111位SHR和141～143位THR氨基酸为蛋白激酶C磷酸化作用位点(protein kinase C phosphorylation site);130～133位 KRSS氨基酸为cAMP及cGMP－依赖型蛋白激酶磷酸化作用位点(cAMP－and cGMP－dependent protein kinase phosphorylation site)。因此可以推测，核转录因子ZNF580可能为p38 MAPK的下游靶点。

转录因子与特异DNA序列结合，通过激活或抑制下游靶基因的表达从而产生广泛的分子效应。为了研究ZNF580在S1P诱导的内皮细胞迁移和增殖中的作用，我们利用pEGFP－ZNF580和ZNF580－siRNA分别转染EA.hy926细胞，获得瞬时过表达和瞬时低表达 ZNF580的 EA.hy926内皮细胞。ZNF580过(低)表达的内皮细胞迁移和增殖活性明显增强(减弱)，提示ZNF580在S1P诱导的内皮细胞迁移和增殖中发挥重要的调控作用。

综上所述，S1P通过 p38 MAPK信号通路增强ZNF580的表达，ZNF580在S1P诱导的内皮细胞迁移和增殖的过程中起着非常重要的调控作用。该研究阐明了一条与血管发生相关的信号转导途径，为探讨ZNF580的功能及其与血管发生之间的关系提供科学依据。

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