转基因及常规水稻穗期对潮霉素的敏感性

李友发，富昊伟，陆 强

(浙江省嘉兴市农业科学研究院，浙江 嘉兴 314016)

潮霉素B是一种氨基糖苷类抗生素，可破坏细胞中核糖体的功能。水稻中潮霉素通过单键细胞叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合位点，从而抑制肽链的延长，破坏细胞功能，使敏感组织褐化死亡而呈现毒性症状。潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)导入水稻后，使细胞具有了潮霉素磷酸转移酶(HPT)活性，从而可忍耐较高浓度的潮霉素毒性，因此，在水稻转基因育种中，hpt基因已成为最有效的选择基因之一。先期通过农杆菌介导法转育的Bt克螟稻都携带潮霉素抗性基因Hyg，在商业化生产竞争中处于不利地位。在尝试通过诱变或遗传学手段将Hyg基因与Bt基因分离的研究中，对群体中潮霉素敏感植株的快速、有效的筛选方法至关重要。有关潮霉素的处理效果除对浸种催芽［1］或离体叶片［2］有简短报道外，也曾有用潮霉素处理水稻活体的幼苗的报道［3］。在实际应用中，我们发现水稻幼苗鉴别虽然有效，但仍存在较多干扰因素，特别是在应用于诱变群体中低频率的突变株筛选时，幼苗期的观察效果不够直观。本研究中我们探索了水稻潮霉素敏感型在穗期的鉴定方法，并对其在大群体筛选试验中的应用效果进行了研究。

1 材料与方法

参试水稻品种为克螟稻R1号与R28。克螟稻R1号系浙江大学核农所选育的带有hpt基因的Bt转基因“三系”籼稻恢复系，R28系嘉兴市农科院育成的常规籼稻恢复系，不带hpt基因。

试验用潮霉素B为Roche公司产品，用清水配成50，75，100 mg·L－13种浓度水溶液。注射方法为:各处理选择克螟稻R1号与R28各20株，当主穗处于幼穗分化八期(穗将伸而未破苞见穗阶段)时，用医用小针头将上述浓度的潮霉素溶液注入穗苞，每个穗苞约注入0.5～1.0 mL。植株抽穗后，观察稻穗的中毒症状并统计中毒穗粒数。喷施方法为:各处理群体40株，喷施时期为始穗期—齐穗期，此时所有植株主穗已抽出，最迟分蘖尚未抽，有较多中间穗正在抽穗过程中。用手持小喷雾器将潮霉素溶液均匀充分地喷施到穗层。植株完全抽穗后，观察主穗的中毒症状并统计主穗的总粒数和有中毒症状的穗粒数。

2 结果与分析

2.1 中毒症状

试验中，克螟稻R1号无论注射还是喷施，稻穗均没有出现中毒症状，表现对潮霉素有很好的抗性。而R28则表现出不同程度的穗中毒症状。R28抽穗前穗苞注射的典型中毒症状为部分穗粒枯死(图1中A)，这些枯死颖花呈灰白色，不开花散粉，也不能结实，或整个穗苞枯死不能抽穗(图1中B);始穗至齐穗期喷施的典型中毒症状为部分颖花颖壳变黄褐色(图1中C)，没有出现穗苞枯死现象。由于稻穗长度20～30 cm，穗粒枯死、穗苞枯死或颖壳黄褐色，这些中毒症状与正常淡绿色的稻穗差异非常明显，因此在较远的距离就可以目测区分。

图1 潮霉素处理水稻穗期的中毒症状

2.2 剂量效应

潮霉素的毒性反应存在剂量效应，主要表现在注射处理时，在50，75，100 mg·L－1处理下，枯死穗粒数分别为26.3%，27.9%，32.7%，呈增加趋势;各20株注射植株中分别有1，2，3株植株穗苞枯死，也随着剂量增加而增加。喷施试验结果(表1)显示，潮霉素中毒症状表现较注射不明显，主要表现不是枯死，而是颖壳变黄褐色或褐色，这些呈黄褐色的颖花仍能开花散粉，也能正常结实。这类褐色颖壳的穗粒数分别为9.70%，14.6%，16.2%，也随着剂量的增加而增加。

表1 水稻R28注射和喷施潮霉素中毒的剂量效应

3 小结与讨论

本试验是在我们对水稻活体幼苗潮霉素敏感性研究的基础上，进一步发展的对水稻活体穗期潮霉素敏感性的研究。研究表明，抽穗前穗苞注射潮霉素的，其毒性症状主要为穗粒枯死或穗苞枯死;穗期喷施则表现为颖壳黄褐色但仍能正常开花结实。其表现的毒性症状均较叶片斑点状毒性症状易区分。在对12万株诱变M2大群体筛选中进一步证明该毒性症状的可应用性。

先期报道中提出用潮霉素喷施水稻幼苗叶片的方法来鉴别敏感型植株［3］，但在实际应用中我们发现该方法虽然有效，但存在较多干扰因素，主要表现为:因幼苗很小且秧田期播种稠密，喷施时易于漏喷幼苗;幼苗处于快速生长过程中，喷施后7～10 d即会有1～2张新叶出现，这些新叶是不会出现斑点的，这对观察造成干扰;最主要的干扰是水稻叶片的生理性病斑，水稻幼苗在秧苗期会出现各种黄褐斑，如由锈病引起、缺微量元素引起等，更对鉴别造成很大干扰。特别是作为诱变育种低频率的突变性状的筛选方法，幼苗期观察效果不够直观的缺点更加明显。而穗期观察，由于水稻的穗长一般有20 cm左右，且穗粒枯死或黄褐斑与正常稻穗的颜色的区分是十分明显的。穗期喷施筛选效果的高效直观，在诱变突变体的筛选方面具有明显优势。

从筛选成本来看，幼苗期筛选在潮霉素用量方面显然节省很多。如同样的12万株群体，幼苗期处理，估算只需0.5～1.0 g的潮霉素，而穗期喷施，约需150 kg药液，潮霉素实际用量约为15 g，但如果采用双丛或多丛移栽的方式，则同样的群体，可成倍减少潮霉素的用量。

标准基因是遗传工程中的重要工具基因，一般都与目的基因以连锁的方式构建在同一T-DNA上。但是，在获得转基因植株后，从应用角度讲它们就成了多余的甚至不受欢迎的部分，特别是在转基因安全性评价中，对hpt标记基因安全性的忧虑是目前我国转基因安全性评价中的一个重点［4］。虽然通过无标记转基因植物(marker-free transgenic plants，MFTP)培育技术已可获得不带htp标记基因的转基因材料［5－8］，但这些技术只适用于新的MFTP的培育，无法应用于已经育成并具有重要应用价值的转基因植物中标记基因的剔除。如克螟稻及其衍生亲本［9－10］，由于带有 htp基因，已成为获得安全证书的一种制约。通过人工理化诱变，将现有的有重大应用价值转基因材料中的htp基因剔除或部分片段失活，则可在一定程度上排除这种安全性顾虑。

［1］王忠华，舒庆尧，贺华龙，等．Bt转基因水稻对抗生素反应的初步研究［J］．植物生理学通迅，2001，37(2):111－113．

［2］Wang M B，Peter M，Waterhouse．A rapid and simple method of assaying plantstransformed with hygromycin and HPT resistance genes［J］．PIantMolecularBiology Reporter，1997，15:209－215．

［3］王彩霞，吴殿星，沈圣泉，等．转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究［J］．核农学报，2005，19(3):168－171．

［4］应丹平，张恒木，陈剑平，等．提高转基因植物安全性的策略［J］．浙江农业学报，2007，19(2):130－134．

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［6］Subha S，Jacob，K V．Generation of selection marker-free transgenic plants by cotransformation of a cointegrate vector TDNA and a binary vectorT-DNA in one Agrobacterium tumefaciens strain［J］．PlantScience，2002，163:801－806．

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［8］Matsunaga E，Sugita K，Ebinuma H．A sexual production of selectable marker-free transgenic woody plants，vegetatively propagated species［J］．Molecular Breeding，2002，10:95－106．

［9］舒庆尧，叶恭银，崔海瑞，等．转基因水稻“克螟稻”的选育［J］．浙江农业大学学报，1998，24(6):579－580．

［10］吴刚，崔海瑞，舒庆尧，等．GUS组织化学染色法:一种快速筛选抗二化螟转 Bt以 crylAb基因水稻的方法［J］．浙江大学学报:农业与生命科学版，2000，26(2):141－143．