碳酸酐酶抑制剂甲苯磺烷唑胺血浆蛋白结合的特征

王金达，石永平，潘志远，崔文玉，张雁芳，汪 海

(1.军事医学科学院卫生学环境医学研究所，北京 100850;2.北京赛德维康医药研究院，北京 100039)

高原低氧等因素引起的急性高原反应是对高原工作者和进入高原人群的健康的极大的威胁。碳酸酐酶抑制剂醋氮酰胺是美国FDA批准正式用于防治急性高原反应的药物，但其不良反应发生率高，严重影响人体的作业能力［1］。甲苯磺烷唑胺(P-8)是拥有自主知识产权的新型化学结构碳酸酐酶抑制剂，研究发现它可以抑制碳酸酐酶Ⅱ的活性，明显提高小鼠耐低氧能力，其效价和效能均优于醋氮酰胺［2］。

药物血浆蛋白结合率是药物代谢动力学的重要参数之一，本实验采用平衡透析法考察了甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血浆蛋白结合率，为进一步开展甲苯磺烷唑胺的药动学研究提供参考，并为临床合理设计甲苯磺烷唑胺给药方案提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 戴安高效液相色谱仪及色谱工作站(戴安公司，美国);BP211D型分析天平(Sartorius);TDX-1型漩涡混合器 (通达科技);BF-2000M型氮气吹干仪(八方世纪);恒温培养箱(Forma ScientificⅡ，Forma);透析袋(D25mm，截留范围8000-14000，进口分装)。

1.2 药品与试剂 甲苯磺烷唑胺(自制，纯度＞98%);非那西丁(Sigma试剂公司，纯度＞98%);甲醇(色谱纯，安徽时联特种溶剂有限公司);冰醋酸、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠均为分析纯;水为millipore去离子水;人血浆由中国人民解放军307医院提供。

1.3 动物 Wistar大鼠，♀♂各半，180～220 g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号:SCXK-(军)2007-004。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);保护住为 Zorbax Eclipse Plus C18(12.5 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相为0.1%冰醋酸:甲醇(V∶V)=42∶58;柱温为25℃;流速为1 ml·min－1;检测波长为285 nm;进样量为20 μl。

2.2 样品处理

2.2.1 透析内液 取大鼠或人血浆样品150 μl于1.5 ml的离心管中，加入10 mg·L－1非那西丁溶液(内标)20 μl，涡旋振荡器上振荡30 s后，加入二氯甲烷1 ml，涡旋振荡器上振荡3 min。4 000 r·min－1离心5 min，移去上层液体，取下层溶液40℃氮气挥干。残渣用流动相复溶至50 μl，10 000 r·min－1离心 5 min，取上清，进样 20 μl于高效液相色谱仪测定。

2.2.2 透析外液 取透析外液300 μl于1.5 ml的离心管中，加入内标溶液 10 μl，其余操作同“2.2.1”项下血浆样品的处理。

2.3 血浆蛋白结合率的测定［3－4］将长约10 cm的透析袋一端结扎，加入2 ml空白血浆，将其另一端扎紧后，悬浮于盛有20 ml含药缓冲溶液［5］的广口瓶中，并将其放置于37℃的恒温培养箱中使其平衡。透析结束后，分别测定透析袋内血浆药物浓度和透析外液中药物浓度，计算药物的血浆蛋白结合率，并用10%(V/V)高氯酸溶液检查透析外液有无蛋白漏出，弃掉漏出者。

Fig 1 HPLC chromatograms of P-8

3 结果

3.1 专属性 在本实验条件下，甲苯磺烷唑胺出峰时间为15 min左右，内标出峰时间为5.5 min左右，空白透析液和空白血浆中均无杂峰干扰，甲苯磺烷唑胺和内标都能达到良好分离(Fig 1)。

3.2 线性关系

3.3.1 透析内液 精密称取甲苯磺烷唑胺10.0 mg于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得标准贮备液，并用甲醇稀释成浓度不同的标准系列溶液。取空白大鼠或人血浆150 μl，分别加入5 μl不同浓度的标准系列溶液，按“2.2.1”项下方法处理样品，进样检测。以甲苯磺烷唑胺峰面积与内标峰面积的比值对质量浓度进行线性回归，得回归方程见Tab 1。

3.2.2 透析外液 取空白透析液300 μl，分别加入10 μl不同浓度标准系列溶液按“2.2.2”项下方法处理样品，其余同透析内液。回归方程见Tab 1。

Tab 1 Standard curves of P-8

3.3 精密度、准确度及提取回收率 按“3.2”项下方法配制低、中、高3个浓度的模拟血浆样品和模拟透析液样品，按各样品处理方法考察精密度、准确度及提取回收率，结果见Tab 2。

Tab 2 Accuracy，precision and recovery of P-8

3.4 稳定性 分别考察“3.3”项下模拟生物样品于－20℃冻藏1周，反复冻融2次，残渣4℃放置2 d和预处理后室温放置24 h的稳定性。此外，考察了含药透析液在37℃恒温培养箱中放置24 h的稳定性。结果，各个浓度样品在上述条件下比较稳定。

3.5 透析膜的吸附考察［5］将含有2 ml空白透析液的透析袋悬浮于盛有20 ml含药透析液的广口瓶中，37℃放置24 h后测定袋外的药物浓度，考察透析膜对药物的吸附。结果，低、中、高3个浓度下吸附率分别为1.70%、7.01%和8.82%，表明透析膜对药物有微量吸附，但其对测试结果的影响可以忽略。

Tab 3 Plasma protein binding rates of P-8

3.6 血浆蛋白结合率的测定 按照“2.3”项下方法操作，考察3个浓度下甲苯磺烷唑胺的血浆蛋白结合率，每个浓度3个样本，分别于不同时间点结束实验，考察透析平衡时间。结果见Tab 3，甲苯磺烷唑胺在24 h时在大鼠或人血浆中透析已达到平衡，大鼠和人的平均血浆蛋白结合率分别为(96.03±0.10)%和(94.24±0.52)%。

通过SPSS 13.0软件对24 h的数据做统计分析，比较各浓度组间血浆蛋白结合率的差异以及甲苯磺烷唑胺与大鼠和人血浆蛋白结合率的差异。结果表明，各浓度组间大鼠和人血浆蛋白结合率差异均无显著性(P＞0.05)，即甲苯磺烷唑胺的血浆蛋白结合率无浓度依赖性;甲苯磺烷唑胺与大鼠和人血浆蛋白结合率有种属差异性(P＜0.05)，大鼠血浆蛋白结合率高于人血浆蛋白结合率。

4 讨论

血浆蛋白结合率的测定是新药临床前研究的重要内容之一，药物在体内与血浆蛋白的结合是一个动态平衡过程，血浆中只有游离型药物才能产生药效。此外，游离型药物的浓度与药物的毒理学过程也密切相关。因此，药物的蛋白结合率研究具有重要意义。

首先建立了甲苯磺烷唑胺血浆样品的HPLC分析方法，该方法快速、简便、选择性强，准确度、精密度均符合生物样品分析方法的要求。平衡透析法是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法，与其他方法相比，具有原理简单，操作方便，成本较低的优点。我们采用平衡透析法对甲苯磺烷唑胺大鼠和人的血浆蛋白结合率进行了比较研究，结果表明甲苯磺烷唑胺与大鼠和人的血浆蛋白都有较强的结合(血浆蛋白结合率＞90%)，无浓度依赖性，说明在0.1～0.5 mg·L－1范围内，甲苯磺烷唑胺与血浆蛋白的结合未达到饱和;甲苯磺烷唑胺与大鼠和人血浆蛋白结合率有种属差异性，大鼠血浆蛋白结合率高于人血浆蛋白结合率。

综上，本研究首次建立了甲苯磺烷唑胺生物样品的测定方法，并对甲苯磺烷唑胺大鼠和人血浆蛋白结合率进行了比较研究，这将为下一步临床前药代动力学研究奠定基础。甲苯磺烷唑胺的血浆蛋白结合率很高，提示当其与其它高蛋白结合率的药物同时应用于临床时，我们应该注意它们与血浆蛋白结合的竞争作用。

［1］ 汪 海.职业性高原病药物治疗学［M］.北京:军事医学科学出版社，2010:303 －6.

［1］ Wang H.Drug therapeutics of occupational plateau disease［M］.Beijing:Military Medical Science Press，2010:303 －6.

［2］ 舒玉刚，张东祥，肖忠海，等.碳酸酐酶靶向性抑制剂甲苯磺烷唑胺对机体缺氧耐力的影响［J］.中国应用生理学杂志，2011，27(3):276－9.

［2］ Shu Y G，Zhang D X，Xiao Z H，et al.Effect of neotype carbonic anhydrase target-based inhibitors(P-8)on the hypoxic tolerance in mice［J］.Chin J Appl Physiol，2011，27(3):276 －9.

［3］ 冯志强，韩 坚，谢智勇，等.黄芩提取物中黄酮类成分血浆蛋白结合率的测定［J］.中国药理学通报，2012，28(2):286 －9.

［3］ Feng Z Q，Han J，Xie Z Y，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in scutellaria baicalensis Georgi［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):286 －9.

［4］ 周 玲，居文政，刘子修，等.灯盏细辛注射液多成分血浆蛋白结合率测定［J］.中国药理学通报，2011，27(5):719－22.

［4］ Zhou L，Ju W Z，Liu Z X，et al.Determination of plasma protein binding rate of multicomponent in Dengzhanxixin injection［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(5):719 －22.

［5］ 刘 晓，陈晓辉，刘文涛，等.阿比朵儿人血浆蛋白结合率的测定［J］.中国新药与临床杂志，2007，26(2):115 －9.

［5］ Liu X，Chen X H，Liu W T，et al.Determination of plasma protein binding rate of arbidol［J］.Chin J New Drugs Clin Rem，2007，26(2):115－9.