香附抗炎镇痛组分纯化方法研究

赵洪超

沈阳市苏家屯区中医医院制剂室，辽宁沈阳 110101

香附为莎草科植物莎草Rhizoma cyperi rotundusL.的干燥根茎，其功效为行气解郁，调经止痛，常用于治疗肝郁气滞，胸、胁、脘腹胀痛，消化不良，胸脘痞闷，寒疝腹痛，乳房胀痛，月经不调，经闭痛经。香附中主要含有挥发油类成分，此外还有黄酮类、皂苷类、生物碱类、糖类、酚类和萜类等。现代药理学研究表明，香附中挥发油以外的成分具有显著的抗炎、镇痛作用。因此，对香附挥发油以外成分进行纯化富集具有积极意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV-1801型紫外分光光度计；HSS型电子恒温水浴锅；RE-52AA型旋转蒸发器；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵。

1.2 试药

香附药材，HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450型树脂；AB-8、NKA-9、D101型树脂；芦丁对照品（供含量测定用，批号：080-9002，中国药品生物制品检定所）；氢氧化钠；亚硝酸钠；硝酸铝。

2 方法与结果

2.1 紫外分光光度法

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品9.29 mg，用甲醇溶解，将其定容至50 mL容量瓶中，即得到浓度为0.1858 mg/mL芦丁标准溶液。

2.1.2 检测波长的选择 精密吸取芦丁标准溶液2 mL，置于10 mL容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，然后加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，最后加入4.0 mL的4%氢氧化钠溶液，摇匀，静置15 min。将得到的溶液，用紫外分光光度计，在200～800 nm范围内进行全波长扫描，结果在510nm有最大吸收峰，故确定检测波长为510nm。

2.1.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL芦丁标准溶液置于10mL容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，然后加入0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，最后加入4.0 mL的4%氢氧化钠溶液，摇匀，静置15 min。再取甲醇定容。用紫外分光光度计，在510 nm测定对照品溶液的吸收度，对照品溶液与吸收度的线性关系为y=10.314x+0.0506,R=0.9996。香附中总黄酮含量以芦丁计在0.02～0.08 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 香附中总黄酮成分纯化工艺考察

2.2.1 静态吸附与解吸实验（优选树脂）①供试液的制备：准确称取香附药材粗粉100g，10倍量60%乙醇回流提取两次每次1h，过滤，合并滤液，挥散溶剂，加水定容至500mL量瓶中（0.2g·mL-1）。②树脂的预处理：选择经95%乙醇浸泡24h的D101、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450、AB-8、NKA-9七种树脂，湿法上柱，用95%乙醇洗脱，控制流速，待流出液与水1：5混合不产生浑浊后，用大量纯化水将树脂洗至无乙醇味，抽滤，备用。③静态吸附与解吸：静态吸附：准确称取D101、HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-450、AB-8、NKA-9 7种树脂各1 g，至100 mL锥形瓶中，加入0.2g·mL-1样品溶液50 mL。每10分钟振摇20 s，持续3 h,吸取吸附后溶液,紫外分光光度法测定总黄酮含量。

静态洗脱：将静态吸附的树脂，抽滤，加50 mL 95%乙醇解吸，每10分钟振摇20 s，持续3 h，吸取解吸液，紫外分光光度法测定总黄酮含量。结果见表1。

表1 静态吸附与解析实验结果

静态吸附与解析实验表明，AB-8型号树脂的饱和吸附量和解析率均相对较高，故确定AB-8树脂为香附总黄酮纯化最佳树脂。

2.2.2 动态吸附与解析实验 ①供试液的制备：准确称取香附药材粗粉100 g，10倍量60%乙醇回流提取2次每次1 h，过滤，合并滤液，挥散溶剂，加水定容至1000 mL量瓶中（0.1g·mL-1）。②泄漏曲线的考察：取已处理好的湿树脂10 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液，上柱流速调节为2 BV/h（每小时2倍树脂柱体积），收集流出液，每份10 mL，测定其总黄酮含量。结果表明，上样至第4份时，流出液中总黄酮含量显著增大，说明此时开始香附总皂苷明显泄漏，故确定数值最大上样量为30 mL，即树脂比上柱量为3g/10 mL（药材/湿树脂）。③解析液浓度的考察：取已处理好的湿树脂50 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液50 mL，以5BV（5倍树脂柱体积）水洗脱后，依次用150 mL的10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，流速2BV/h，分别收集各乙醇浓度解析液，挥散溶剂，定容至50 mL量瓶中，测定其中香附总黄酮含量。结果表明，50%乙醇即可将芍药苷和白芍总苷进行有效洗脱，因此将50%乙醇确定为最佳洗脱溶剂。④解析液用量的考察：取已处理好的湿树脂50 mL，加入0.1g·mL-1的香附提取液50 mL，以5BV水洗脱后，用50%乙醇洗脱，流速2 BV/h（每小时2倍树脂柱体积），每50 mL收集1份洗脱液，测定其种香附总黄酮含量。结果表明，当洗脱液用量达到5 BV时，已经基本将香附总黄酮洗脱干净，因此确定解吸液用量为5个树脂柱体积。

2.3 结果

本试验针对香附总黄酮分离纯化工艺进行研究，7种大孔树脂中，AB-8树脂最适合分离纯化香附总黄酮，上样量为香附药材与树脂体积比为3∶10(g·mL-1)，采用50%乙醇洗脱5个柱体积效果最佳。

3 讨论

大孔吸附树脂是一类具有较好吸附性能的高聚物吸附剂，当前在中药制剂纯化、天然药物活性成分的提取分离方面也显示出独特的作用。

在香附中黄酮含量有限，因此如何有效的纯化富集香附中的黄酮成分显得十分重要。

本实验考察了不同大孔吸附树脂对香附总黄酮的吸附和解吸特性，筛选出较为理想的纯化富集香附总黄酮的AB-8大孔吸附树脂，并通过动态吸附于解析实验，确定了香附总黄酮的纯化富集工艺，纯化后的香附总黄酮的纯度为香附总黄酮纯度为63.44%，原纯度为9.24%，纯度提高6.9倍。

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